Multiplex oligonucleotide ligation assay
Simultaneous and sensitive detection of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) drug resistant genotypes by multiplex oligonucleotide ligation assay
UVOD
HIV (humani virus imunske pomanjkljivosti) spada med retroviruse in je povzročitelj AIDS-a. Največja težava pri zdravljenju okužbe z virusom HIV je izjemno hitra sposobnost mutacij virusnega RNA genoma, zato se hitreje razvije odpornost na večino zdravil. V ta namen so v Združenih državah Amerike (ZDA) in Evropi razvili smernice, ki priporočajo, da bi se osebe, ki so okužene z virusom HIV, testirale na prisotnost odpornosti na antiretrovirusna (ARV) zdravila pred začetkom zdravljenja z antiretrovirusno terapijo (ART). Tako bi lahko že prej izbrali ustrezna in učitkovita zdravila in ne bi izgubljali časa z neustreznim zdravljenjem, prav tako bi lahko omejili širjenje na zdravila odporne viruse HIV in prihranili na denarju. Trenutno se za ugotavljanje odpornosti na ARV zdravila rutinsko uporablja konsenzno sekvenciranje plazemske RNA virusa HIV, ki je drago in manj občutljivo pri detekciji nizkih koncentracij mutant, odpornih na zdravila. Dostop do zdravljenja se je na območjih z omejenimi viri v zadnjem desetletju povečal, ni pa ustrezne in dovolj cenovno ugodne metode za spremljanje zdravljenja. Zato se je povečalo število oseb, okuženih z odpornimi različicami virusa HIV. Preizkus ligiranja oligonukleotidov oz. OLA je alternativna metoda za občutljivo in enostavno detekcijo točkovnih mutacij, ki so povezane z odpornostjo na ARV zdravila za HIV.
EKSPERIMENTALNI DEL
Preizkus OLA za enojne rezistenčne mutacije (singleplex OLA, SPX-OLA): OLA sonde so uporabili za detekcijo mutacij, ki so povezane z odpornostjo na genu, ki kodira za reverzno transkriptazo virusa HIV. Te mutacije so K65R in M184V, ki omogočajo odpornost na nukleozidne inhibitorje reverzne transkriptaze (NRTI; tenofovir, lamivudin) in K103N, V106M, Y181C in G190A, ki omogočajo odpornost na ne-nukleozidne inhibitorje reverzne transkriptaze (NNRTI; nevirapin). Za eksperiment so uporabili PCR amplikone (pomnožen gen HIV pol) različnih oseb, okuženih z virusom HIV, ki so jih pridobili iz plazme ali krvi z verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Za potrditev so vzorce nanesli na 3% agarozni gel. Mutacije na enem kodonu so detektirali z uporabo treh oligonukleotidnih sond. Prva je bila namenjena detekciji mutiranega genotipa in označena s fluoresceinom, druga je bila za detekcijo divjega tipa in označena z digoksigeninom, tretja, označena z biotinom, pa je ujela ligiran produkt za kasnejšo detekcijo (t. i. skupna sonda). Dodali so jih k ligacijski reakciji, ki je vsebovala še PCR amplikon, različne pufre in termostabilno ligazo. Ligacija je potekala 10 ciklov. Vzorce so prestavili v drugo mikrotitrsko ploščico, ki je bila prevlečena s streptavidinom. Pri tem so se nanj vezali biotinilirani konci ligiranega produkta. Najprej so dodali protitelesa proti digoksigeninu, konjugirana s peroksidazo in protitelesa proti fluoresceinu, konjugirana z alkalno fosfatazo, nato pa še substrat za alkalno fosfatazo in pustili, da se je razvila barva. Absorbanco so merili pri 490 nm. Ploščo so sprali in dodali substrat za hrenovo peroksidazo; absorbanco so merili pri 450 nm.
Preizkus OLA za dvojne rezistenčne mutacije (multiplex OLA, MPX-OLA): Vzorci so bili enaki, kot pri SPX-OLA. Pri tej različici metode OLA so detektirali dve mutaciji hkrati. Za to sta bili potrebni dve oligonukleotidni sondi za detekcijo mutiranih genotipov (označeni s fluoresceinom in digoksigeninom) in ena skupna sonda, označena z biotinom. Sonda za detekcijo divjega tipa ni bila označena. Ligacijsko reakcijo so izvedli na podoben način kot pri SPX-OLA in dodali enaka protitelesa ter substrate. Preizkus MPX-OLA je zanesljivo detektiral kodonske pare 103/181, 106/190 in 65/184 v primerjavi s SPX-OLA. Z MPX-OLA neopredeljenih rezultatov ne moremo detektirati, ker ne merimo reakcije z divjim tipom. To pomeni, da je lahko negativna reakcija rezultat polimorfizmov ali pa vzorec ni imel mutacije na testiranemu kodonu. To je slaba stran MPX-OLA, saj je detekcija divjega tipa in neopredeljenih reakcij s SPX-OLA mogoča. Slabost metode MPX je tudi zmanjšana detekcija ene ali obeh mutacij, če sta kodona, pri katerih testiramo mutaciji, blizu skupaj na genomu in je bila potrebna uporaba prekrivajočih se sond. Zato so izbrali hkratno testiranje mutacij, ki sta bili na genomu dovolj narazen (103/181, 106/190, 65/184) in so pri tem uporabili neprekrivajoče se sonde. Spodnja meja detekcije je podobna, kar nakazuje na visoko občutljivost obeh različic metode OLA. V tej raziskavi so želeli pokazati, da se OLA lahko prilagodi tako, da poteka detekcija genotipov HIV, ki so odporni na ARV zdravila, na dveh kodonih hkrati. Metodo odlikuje tudi enostavnost.
ZAKLJUČEK
Študija je demonstrirala, da je MPX-OLA enako občutljiv in specifičen test kot SPX-OLA pri detekciji točkovnih mutacij, ki povzročajo na ARV zdravila odporne genotipe HIV. Na splošno je OLA veliko uspešnejši pri zaznavanju redkejših mutacij (2-5 % vse virusne populacije) kot sekvenciranje, ki zazna le glavnino (>50 %) populacije, hkrati pa je tudi cenejši in enostavnejši za uporabo, zato bi lahko bil bolj dostopen v državah tretjega sveta, kjer so virusne rezistenčne mutacije v porastu.
VIR
Ellis G. M., Vlaskin T. A., Koth A. et. al. Simultaneous and sensitive detection of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) drug resistant genotypes by multiplex oligonucleotide ligation assay. Journal of Virological Methods, 192, (2013), 39– 43.
