NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor

Nanoflex (stilistično NANOFLEX) je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga pripravili podiplomski študenti iz univerze v Uppsali na Švedskem. Projekt je prejel nagrado za najboljšo novo uporabo (angl. Best New Application Award) [1].

Povezava do projekta: https://2020.igem.org/Team:UofUppsala

Avtor povzetka: Martin Špendl

Uvod

Glavna ideja projetka NANOFLEX je ustvariti celični biosenzor za zaznavo poljubnega analita. Njegovo prisotnost in posledično koncentracijo bi odčitali na podlagi spremembe barve, ki bi bila vidna s prostim očesom. Biosenzor je namenjen predvsem detekciji malih molekul, medtem ko je teoretično možna tudi detekcija proteinov [1].

Glavni cilji projekta so bili:

• ustvariti kalorimetričen, modularen celični biosenzor na osnovi nanoteles
• validacija sistema na realnih vzorcih
• demonstracija prototipa z dolgo življensko dobo in uporaba na terenu

Celični biosenzorji izrabljajo celične komponente kot detekcijski sistem, medtem ko z genetskimi modifikacijami dosežemo specifičnost in merljivost signalov. Analiti so lahko različne vrste substanc, kot na primer toksini, proteini, nukleinske kisline, bakterije in virusi. Njihova prednost je tudi v tem, da omogočajo hiter odziv na signal in se s časom ne denaturirajo. Nizka cena celičnih biosenzorjev pa je posledica tega, da proteinov za detekcijo ni potrebno izolirati in očistiti [2].

Delovanje celičnega biosenzorja

Osnovni princip (Prva generacija)

Osnovni princip delovanja celičnega biosenzorja NANOFLEX sloni na proteinu CadC iz gram negativne bakterije E. coli. CadC je transmembranski protein, ki ima zunajcelično ligand vezavno domeno in citosolno DNA vezavno domeno (DBD). Aktivacija je povezana z nizkim zunajceličnim pH in visoko koncentracijo lizina, ki privede do dimerizacije zunaj celice in posledično dimerizacije DBD domene v citosolu. DNA vezavna domena prepoznava dve mesti za vezavo na operonu cadBA, in sicer Cad1 in Cad2. Vezava DBD na Cad1 odstrani homodimer proteina H-NS (angl. histone-like nucleoid-structuring), pri čemer se sprosti še drugo vezavno Cad2 in omogoči transkripcijo. Prisotnost ransporterja lizina LysP inhibira dimerizacijo CadC [3].

Po zgledu raziskovalcev (Chang et al. [4]) so zunajcelično ligand vezavno domeno zamenjali z nanotelesom proti molekuli kofeina. Za ta nanotelesa je znano, da ob vezavi kofeina tvorijo homodimer, kar je ključnega pomena za delovanje biosenzorja. Tvorba dimera nato sproži dimerizacijo citosolne DNA vezavne domene in posledično vezavo na operon cadBA [4]. Vezava sproži transkripcijo reporterskega gena z zapisom za GFP, ki pa so ga zamenjali z zapisom za rdeči fluorescenčni protein (mRFP) za boljšo vizualno oceno koncentracije analita. Vizualno se sprememba barve opazi kot krvavo rdeča raztopina ob prisotnosti kofeina [1].

Izboljšave (Druga generacija)

Osnovni princip biosenzorja je enostaven, zato so študenti predlagali dodatne teoretične izboljšave sistema, ki bi izboljšale razmerje signal/šum ter hkrati naredile sistem bolj robusten in prenosljiv [1].

Uporaba gram negativne bakterije (E. coli) za detekcijo malih molekul je primerna, saj male molekule lahko prehajajo zunanjo celično membrano. V primeru detekcije manjših proteinov permeabilnost postane ovira, zato so predlagali odstranitev zunanje membrane in uporabo sferoplastov. Alternativno so predlagali uporabo gram pozitivnih bakterij (npr. Bacillus subtilis), pri katerih lahko proteini do 50 kDa prehajajo celično steno in dosežejo nanotelesa. Izpostavili so tudi problem večjih proteinov, ki bi ga lahko reševali z uporabo gram pozitivnih bakterij brez celične stene. Smernice so zbrali v priročniku [1].

Izboljšave samega mehanizma delovanja predpostavljajo popolnoma drug mehanizem prenosa signala in metode detekcije. Prenos signala skozi membrano bi ostal enak, medtem ko bi bila pod regulacijo operona cadBA proteina RNA polimeraza faga T7 in proteaza TEV. Ob nizikih koncentracijah analita, spontani dimerizaciji in puščanju promotorja bi RNA polimeraza faga T7 tvorila kompleks z lizocimom faga T7, ki inhibira njeno delovanje. S tem bi ustavili prenos signala in efektivno zmanjšali šum [1].

Ob višjih in analitsko bolj relevantnih koncentracijah bi število RNA polimeraz faga T7 preseglo lizocime faga T7, pri čemer lahko poteče transkripcija genov, ki jih regulira promotor RNA polimeraze faga T7. S tem steče prepis mRNA z zapisom za β-galaktozidazo. Ob dodatku substrata X-Gal v gojišče ga lahko proizveden encim cepi in tvori modro obarvan substrat 4-kloro-3-bromo-indigo [1].

Dodaten mehanizem povečanja signala predstavlja virusna replikaza Qβ. Regulacija tega gena je prav tako regulirana preko promotorja RNA polimeraze faga T7, kar pomeni, da se prepisuje sočasno z β-galaktozidazo. Replikaza Qβ tvori kompleks še s tremi proteini E. coli, in sicer transkripcijskima faktorjema EF-Tu in EF-Ts ter proteinom S1. Njena funkcija pri virusni okužbi z bakteriofagom Qβ je replikacija virusne ssRNA v protismerno in nato smerno ssRNA. S tem sistemom lahko v celici povečamo koncentracijo želene mRNA neodvisno od transkripcije. Več kopij mRNA privede do več kopij β-galaktozidaze in posledično več obarvanega produkta. Pomembno je omeniti, da za uspešno povečanje koncentracije mRNA z replikazo Qβ potrebujemo mRNA s specifičnimi 5’ in 3’-UTR motivi, vezavno mesto znotraj mRNA in sev E. coli z izbitim genom rnc, katerega produkt vpliva na razgradnjo dsRNA [5, 6].

Z namenom regulacije same replikaze Qβ bi ji dodali C-končno LAA oznako (ena od variacij LVA oznak), ki signalizira hitrejšo razgradnjo encima. Kot protiutež pa bi pred LAA oznako dodali cepitveno mesto za proteazo TEV, ki bi pri visokih koncentracijah analita oznako odcepila [1].

Izboljšav v laboratoriju študenti niso izvedli, so pa pripravili biokocke posameznih enot sistema, če le te niso bile del patentov [1].

Validacija biosenzorja

Validacijo celičnega biosenzorja so izvedli z inkubacijo transformiranih bakterij pri različnih koncentracijah kofeina, in sicer med 0 in 100 µM. Vse poskuse so izvedli v paralelkah po tri. Negativna kontrola so bile ne transformirane celice. Fluorescenco celičnih kultur so izvedli 3,5 ure po začetku inkubacije v raztopini kofeina. Izvedli so samo validacijo prve generacije celičnega biosenzorja [1].

Dokazali so, da je rdeče obarvanje sorazmerno s koncentracijo kofeina v območju med 0 in 20 µM, medtem ko se pri višjih koncentracijah signal nasiči in ne spreminja. Pri koncentraciji kofeina 0 µM se tudi pojavi šibko rdeča barva, kar je najverjetneje posledica puščanja promotorja [1].

Uporaba stohastičnega modela z uporabo algoritma Gillespie [7] pokaže nasičenje signala pri 10 µM raztopini kofeina in višjih koncentracijah, kar sovpada z eksperimentalnimi podatki. Tudi testiranje celičnega biosenzorja na vzorcih kave in brezkofeinske kave so pokazali, da je razlika med obema opazna in hkrati to, da brezkofeinska kava vsebuje majhen delež kofeina (v njihovem primeru 3 mg). S tem so dokazali uporabnost NANOFLEX na realnih vzorcih [1,8].

Standardizacija kloniranja

V okviru standardizacije postopka je skupina študentov naredila nekaj izboljšav in priročnik za standard RFC 1000, ki uporablja kloniranje z restriktazo tipa IIS. Priročnik je dostopen na spletu.

Uporaba celičnega biosenzorja

Embalaža biosenzorja

Pri izdelavi embalaže so se študentje zgledovali po šestih konceptih dobre prakse. V splošnem so želeli narediti embalažo, ki bo enostavna za uporabo, varna, ekološka in imela enostavno proizvodnjo.

Embalažo biosenzorja predstavlja 40 mm visoka in 26 mm široka valjasta posoda s tremi prekati. Prvi iz vrha je namenjen vzorcu in je od druge ločen z aluminijasto membrano. Srednji prekat je namenjen reakcijski raztopini s pufrom in potencialno X-gal. Med srednjim in spodnjim prekatom sta dve aluminijasti membrani, ki preprečujeta gensko spremenjenim bakterijam, da bi pobegnile izven sistema. Bakterije so liofilizirane, da se njihovo število ne spreminja, medtem ko test čaka na uporabo. Z uporabo pokrovčka z dolgo paličico na spodnji strani predremo vse tri membrane in s tem združimo liofilizirane bakterije, reakcijski pufer in naš vzorec.

Ker gre za uporabo gensko spremenjenih bakterij, je potrebno le-te kontrolirano zapreti v prekate, ki ne bodo prišli v stik z drugimi tekočinami in ne morejo uiti iz embalaže. To so dosegli z uporabo že omenjenih aluminijastih membran med kompartmenti, kljukic in Teslovega ventila (angl. Tesla Valve). Kljukice na vrhu pokrovčka se ob predrtju membran zataknejo za zgornji del posodice, s čimer onemogočajo ponovno odprtje posodice in razlitja bakterij. Na straneh paličice so ventili, ki usmerjajo tok tekočine v smer proti dnu posode in preprečijo prehajanje v višje prekate. Stična površina med pokrovčkom in posodico je okrepljena z gumijastim premazom, ki zatesni morebitno odprtino na robu. Načrt embalaže je dostopen na povezavi.

Primer uporabe: Detekcija Mycobacterium tuberculosis

Kot teoretičen primer uporabe so študenti opisali detekcijo Mycobacterium tuberculosis, povzročitelja tuberkuloze. Po podatkih WHO je leta 2019 1,4 milijona ljudi umrlo za posledicami tuberkuloze. Testiranje in diagnoza sta pogosto dragi in zahtevni, še posebej v revnejših državah. Potreba po enostavnih in cenovno ugodnih testih je velika in NANOFLEX predstavlja dobro alternativo na tem področju [1, 9].

Med glavnimi tarčami sta bila IFN-γ in HSP16.3, med katerima so izbrali HSP, proti kateremu že obstaja znano nanotelo BF10. Z uporabo molekulskega prileganja in minimizacije energije kompleksa so izbrali najbolj verjeten model vezave, ki so ga optimizirali še z uporabo molekulske dinamike. Med simulacijo molekulske dinamike so proteina “vlekli” narazen in izračunali energijo, ki je potrebna za razpad kompleksa. Preko te energije so sklepali na afiniteto vezave. Celoten primer uporabe je bil narejen izven laboratorija, medtem ko so simulacije potekale na oblaku univerze [1].

Viri

1. NANOFLEX: Standardized, Flexible and Accessible Cellular Biosensor (iGEM wiki). Dostopano 3. 5. 2021; Povezava: https://2020.igem.org/Team:UofUppsala
2. Asphahani, F., & Zhang, M. (2007). Cellular impedance biosensors for drug screening and toxin detection. The Analyst, 132(9), 835. doi:10.1039/b704513a
3. EcoCyc database, cadC DNA-binding transcriptional activator CadC; Dostopano 3. 5. 2021; Povezava: https://biocyc.org/gene?orgid=ECOLI&id=EG10133
4. Chang, H.-J., Mayonove, P., Zavala, A., De Visch, A., Minard, P., Cohen-Gonsaud, M., & Bonnet, J. (2017). A Modular Receptor Platform To Expand the Sensing Repertoire of Bacteria. ACS Synthetic Biology, 7(1), 166–175. doi:10.1021/acssynbio.7b00266
5. Yao, Y., et al. (2019). A Direct RNA-to-RNA Replication System for Enhanced Gene Expression in Bacteria. ACS Synthetic Biology. doi:10.1021/acssynbio.8b00521
6. Wiedbrauk, D. L., & Drevon, A. M. (1995). Nucleic Acid Detection Methods. Molecular Methods for Virus Detection, 1–24. doi:10.1016/b978-012748920-9/50002-9
7. Gillespie, D. T. (1977). Exact stochastic simulation of coupled chemical reactions. The Journal of Physical Chemistry, 81(25), 2340–2361. doi:10.1021/j100540a008
8. iGEM Uppsala 2020- Github repository; Dostopano 3. 5. 2021; Povezava: https://github.com/igemsoftware2020/iGem2020Uppsala
9. Tuberkuloza (TB) - spletna stran WHO; Dostopano 3. 5. 2021; Povezava: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/tuberculosis