Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih

1. Uvod

Že več let je znano, da fosilno gorivo ni obnovljiv vir energije in da ga lahko še prehitro zmanjka, upoštevajoč svetovne potrebe po njem. Prav tako pa že več let znanstveniki razvijajo sisteme za proizvodnjo biogoriv v mikroorganizmih, predvsem etanola, ki se ga je leta 2010 proizvedlo že skoraj 50 milijard litrov (Fichman, 2011). Vendar pa etanol ni popolno biogorivo; je higroskopen, njegova energijska gostota pa je v primerjavi z bencinom dokaj nizka (Li et al., 2010). Za razliko od etanola pa so alkoholi z daljšimi verigami bolj primerni za proizvodnjo biogoriv.

Z izjemo 1-butanola, ki ga v naravi sintetizirajo bakterije iz rodu Clostridium, ostalih alkoholov z daljšimi verigami ne najdemo v naravi, zato se veliko raziskav ukvarja z razvojem takšnih laboratorijskih sevov, ki bi učinkovito pretvarjali biomaso v alkohole z daljšimi verigami in predvsem v dovolj velikih količinah. Najbolj primerne za to so bakterije E. coli oz. kvasovke S. cerevisiae tudi zato, ker so za tovrstne organizme na voljo različne tehnike za genetsko manipulacijo in ker imajo znano in tudi precej preprosto fiziologijo.

Tradicionalni pristop k vpeljevanju metabolnih poti v mikroorganizme je metabolično inženirstvo, ki pa ga je možno izboljšati z uporabo pristopov sintezne biologije (Agapakis in Silver, 2009; Khalil in Collins, 2010). Tako lahko s kombiniranjem bioloških komponent iz različnih organizmov ustvarimo nove in boljše metabolne poti v gostiteljskem organizmu.

2. Proizvodnja izopropanola

Izopropanol je enostaven sekundarni alkohol, ki ga lahko uporabljamo namesto metanola za esterifikacijo maščob in olja za proizvodnjo biodizla ali pa ga uporabimo kot biogorivo. Hanai et al., so leta 2007 prvi uspeli prenesti metabolno pot za proizvodnjo izopropanola v bakterije E. coli, kasneje pa so efektivnost proizvodnje izopropanola še izboljšali. Sintezno pot so ustvarili s kombinacijami genov iz različnih organizmov; Clostridum acetobutylicum, E. coli, Clostridium beijerincki in Thermoanaerobacter brockii.

Sintezno pot so zasnovali na podlagi sintezne poti v bakteriji C. beijerinckii, kjer najprej acetil-CoA acetiltransferaza katalizira kondenzacijo dveh molekul acetil-CoA v acetoacetil-CoA. Nato acetoacetil-CoA transferaza katalizira pretvorbo v acetoacetat, iz katerega ob delovanju acetoacetat dekarboksilaze nastaneta aceton in CO2. Na koncu poti sekundarna alkoholna dehidrogenaza pretvori aceton v izopropanol (Hanai et al., 2007).

Za najboljšega se je izkazal sev, ki je vseboval gen thl (acetil-CoA aciltransferaza) iz C. acetobutylicum, gen atoAD (acetoacetil-CoA transferaza) iz E. coli, gen adc (acetoacetat dekarboksilaza) iz C. acetobutylicum in gen adh (sekundarna alkoholna dehidrogenaza) iz C. beijerinckii. Tak sev je proizvedel 2,7 g/L izopropanola (Hanai et al., 2007).

Leta 2010 so Inokuma et al., izboljšali proizvodnjo izopropanola v E. coli tako, da so optimizirali tako kulturo bakterij kot pogoje v gojišču. Izplen so povečali tudi tako, da so produkt odvajali z metodo »gas stripping«. Sprva so sevi po 144 urah proizvedli 79,6 g/L izopropanola, če pa so zagotovili reden vnos svežih nutrientov pa je proizvodnja izopropanola narasla na 143 g/L v 240 urah.

3. Proizvodnja butanola

1-butanol je po svoji energijski gostoti (29 MJ/L) precej podoben bencinu in ker ga v naravi proizvajajo bakterije iz rodu Clostridium so bile prve raziskave osredotočene na optimizacijo proizvodnje butanola v omenjenih bakterijah, vendar slednje niso prinesle željenega uspeha, zato so se raziskovalci osredotočili na vnos poti v E. coli (Lutke-Evershol in Bahl, 2011).

Za eno molekulo butanola mora Clostridum uporabiti eno molekulo glukoze in štiri molekule NADPH-ja, sintezo pa omogoča šest genov; thl, hbd, crt, bcd, etfAB, in adhE2. Prenos sintezne poti butanola v E. coli se je za razliko od nekaterih drugih sinteznih poti, izkazal za precejšen izziv.

Glavni problem pri prenosu sintezne poti tiči v pomanjkanju gonilne sile, ki bi poganjala pretvorbo acetil-CoA v butanol. Clostridium pri sintezi butanola uporablja NADPH in reduciran ferodoksin. Če bi ustvarili tako sintezno pot v kateri bi se za procese redukcije uporabljal le NADPH, bi lahko posledično akumulacijo NADPH-ja uporabili kot gonilno silo. V E.coli lahko to dosežemo z delecijo nekaterih genov, katerih produkti omogočajo določene fermentacijske procese v celici; ∆adhE, ∆ldhA in ∆frd. Tak sev sicer izgubi sposobnost rasti v anaerobnih pogojih, kakor tudi sposobnost recikliranja NADPH-ja, vendar pridobi gonilno silo za tiste reakcije, ki porabljajo NADPH (Shen et al., 2011).

Četudi gonilna sila v obliki akumuliranega NADPH-ja obstaja, mora biti ta učinkovito sklopljena s procesom sinteze butanola. Da to dosežemo moramo spremeniti en del poti tako, da kompleks butiril-CoA dehidrogenaza (Bcd-EtfAB) uporablja izključno NADPH za pretvorbo krotonil-CoA v butiril-CoA. Za prenos poti v E. coli se je izkazalo, da je bolje uporabiti encim trans-enoil-CoA reduktazo (Ter) kot prej omenjen kompleks, saj lahko Ter direktno uporablja NADPH, prav tako pa je ta reakcija ireverziblna, kar pomeni, da je ravnotežje pomaknjeno v smer nastanka butanola (Shen et al., 2011).

Akumulacija NADPH-ja v celici ni dovolj, da bi dosegli zadovoljive koncentracije butanola, zato so raziskovalci poskušali poiskati dodatno gonilno silo. Izkaže se, da na hitrost sintezne poti bistveno vpliva prvi korak; kondenzacija acetil-CoA v acetoacetil-CoA, ki jo v Clostridium katalizira acetoacetil-CoA tiolaza (Thl). Zaradi višje specifične aktivnosti, so za ta korak uporabili encim acetil-CoA acetiltransferaza (AtoB), ki izvira iz E. coli. Zaradi tega bi akumulacija acetil-CoA lahko predstavljala drugo gonilno silo za sintezo butanola v E. coli. Slednje so dosegli tako, da so v sevu deletirali gen za fosfat acetiltransferazo, ki v normalnih pogojih porabi večino acetil-CoA (Shen et al., 2011).

Z uporabo opisanih korakov so uspeli pripraviti sev E. coli, ki je proizvedel 30 g/L butanola po sedmih dneh.

4. Proizvodnja 1-heksanola

Sintezna pot za sintezo butanola, ki so jo vstavili v E. coli je služila tudi za vpeljavo sintezne poti za proizvodnjo 1-heksanola. Sinteza heksanola poteka preko C4 intermediatov, ki so jih v sev vpeljali preko vstavljanja istih genov, ki so jih uporabili že Shen in sodelavci, za nadaljnjo pretvorbo v hekasonol pa so uporabili gene za encime iz različnih organizmov (Dekishima et al., 2011).

Vpeljana sintezna pot je bila ista sintezni poti za butanol do stopnje butiril-CoA. Po tej stopnji pa je sledila pretvorba butiril-CoA v 3-ketoheksanoil-CoA s pomočjo encima β-ketotiolaza (BktB) iz Ralstonia eutropha. Sledi pretvorba 3-ketoheksanoil-CoA v 3-hidroksiheksanoil-CoA s pomočjo encima 3-hidroksibutiril-CoA dehidrogenaza (Hbd) iz Clostrodium acetobutylicum in nato pretvorba v heksenoil-CoA s pomočjo encima krotonaza (Crt) iz istega organizma (Dekishima et al., 2011).

Po tej stopnji se mora heksenoil-CoA najprej pretvoriti v heksanoil-CoA, nato v heksaldehid in na koncu v 1-heksanol. Prvo reakcijo katalizira trans-enoil-CoA reduktaza (Ter), zadnji dve pa alkohol/aldehid dehidrogenaza (AdhE2) iz C. acetobutylicum (Dekishima et al., 2011).

Izkazalo se je, da čeprav butanol nastaja v večjih količinah ob prisotnosti reduktaze Ter, morata biti za proizvodnjo heksanola prisotni dve reduktazi. Ko so v sev vpeljali reduktazo EgTer iz Euglena gracilis in reduktazo TdTer iz Treponema denticola so uspeli detektirati heksanol v količini 23 mg/L po 68 urah (Dekishima et al., 2011).

Z optimizacijo gojitvenih pogojev in odvajanja produkta iz gojišča so uspeli pripraviti sev, ki je proizvedel 47 mg/L heksanola po 48 urah (Dekishima et al., 2011).

5. Zaključek

Pristopi sintezne biologije, ki omogočajo modularno izgradnjo biosinteznih poti imajo velik doprinos pri razvoju teh poti v mikroorganizmih v namen proizvodnje biogoriv. Danes obstajata že dve podjetji, Gevo in Butamax, ki proizvajata izobutanol za komercialno uporabo.

Zavedati pa se je treba, da z optimizacijo proizvodnje alkoholov v mikroorganizmih in s tem vedno višjimi koncentracijami le-teh, naletimo na marsikatero oviro. Ena izmed najbolj perečih ovir je toksičnost produkta, kar poslabša fitnes seva in s tem prepreči proizvodnjo produkta v industrijskem merilu. Zato bi bilo potrebno usmeriti pozornost ne samo na večji izplen, temveč tudi na pripravo bolj robustnih sevov. Pozornost bi bilo smiselno usmerit tudi na izhodni material; biomaso. Razvoj postopka za efektivno razgradnjo biomase bi znatno pocenil proces proizvodnje biogoriv, poleg tega pa bi bil postopek tudi hitrejši.

Glede na napredek na področju biogoriv je možno pričakovati, da bomo leta 2022 že proizvedli 136 milijard litrov biogoriva, kakor predvideva svetovna iniciativa in to se zdi toliko bolj verjetno v luči napredka, ki je bil storjen v proizvodnji biogoriv iz alkoholov z daljšimi verigami.

6. Viri

Agapakis, C. M., and Silver, P. A.(2009). Synthetic biology: exploring and exploiting genetic modularity through the design of novel biological networks. Mol. Biosyst. 5, 704–713.

Dekishima, Y., Lan, E. I., Shen, C. R.,Cho, K. M., and Liao, J. C. (2011). Extending carbon chain length of 1-butanol pathway for 1-hexanol synthesis from glucose by engineered Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc.133, 11399–11401.

Fichman, B. T. (2011). Annual energy review 2010. E. I. Administration.

Hanai, T., Atsumi, S., and Liao, J. C.(2007). Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 73, 7814–7818.

Inokuma, K., Liao, J. C., Okamoto,M., and Hanai, T. (2010). Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichia coli using gas stripping. J. Biosci. Bioeng. 110, 696–701.

Khalil, A. S., and Collins, J. J.(2010). Synthetic biology: applications come of age. Nat. Rev. Genet. 11,367–379.

Li, H., Cann, A. F., and Liao, J. C.(2010b). Biofuels: biomolecular engineering fundamentals and advances. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 1,19–36.

Marcheschi, R. J., Li, H., Zhang, K., Noey, E. L., Kim, S., Chaubey, A., Houk, K. N., and Liao, J. C. (2012). A synthetic recursive “+1” pathway for carbon chain elongation. ACS Chem. Biol. 7, 689–697.

Shen, C. R., Lan, E. I., Dekishima, Y., Baez, A., Cho, K. M., and Liao, J. C.(2011). Driving forces enable hightiter anaerobic 1-butanol synthesis in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2905–2915.