Negativna selekcija in spreminjanje striktnosti pri zvezni evoluciji s pomočjo fagov.

1. POVZETEK

Zvezna evolucija s pomočjo fagov (v nadaljevanju PACE) je metoda zvezne evolucije bioloških makromolekul. Zapis za te leži v genomu spremenjenih nitastih fagov, ki se propagirajo v obnavljajoči kulturi gostiteljskih E. coli. Lastnosti oziroma aktivnosti makromolekul so molekularno povezane s proliferativno sposobnostjo nosilnega nitastega faga. To odraža selekcijski pritisk za izboljšanje teh lastnosti makromolekule. V članku avtorji predstavijo dve izboljšavi njihove osnovne metode – uvedbo negativne selekcije in spreminjanje intenzitete selekcijskega pritiska. Njuno uporabnost prikažejo preko razvoja RNA polimeraze T7 s spremenjenim, in ne le razširjenim, prepoznavanjem promotorjev.

2. UVOD

Avtorji so zapis za fagni gen III, ki je ključen za njegovo infektivnost, prestavili na pomožni plazmid (ang. accessory plasmid, AP) gostiteljskih E. coli, v fagni genom pa vstavili zapis za RNA polimerazo T7. Gen III je v AP pod kontrolo promotorja P_T3; neposredna posledica tega je selekcijski pritisk na RNA polimerazo T7 po prepoznavanju P_T3. Tovrstni sistem so že uporabili v eksperimentu izpred treh let, vendar so naleteli na neuspeh – selekcijski pritisk je bil prevelik glede na velikost populacije oziroma njeno diverziteto, da bi omogočali razvoj ustreznih mutant, kar je povzročilo izumrtje faga. Le to so preprečili z uporabo P_T7/T3 hibridega promotorja, ki je deloval kot evolucijski premostitveni kamen med PT7 in PT3. Njihov namen je razviti splošen sistem za razvoj raznovrstnih makromolekul, uporaba premostitvenega kamna pa ni vedno enostavna ali sploh mogoča. S tem razlogom so v metodo uvedli nastavljivo intenziteto selekcijskega pritiska. Ker pa so želeli pripraviti makromolekule s spremenjenimi, in ne le razširjenimi, lastnostmi, so uvedli še metodo negativne selekcije proti prvotnim aktivnostim.

3. SPREMEMBA SELEKCIJSKEGA PRITISKA

V primerih visokega selekcijskega pritiska uspešna prilagoditev zahteva veliko populacijo in diverziteto, v nasprotnem primeru populacija nitastih fagov v mikrookolju izumre. V teh primerih bi radi znižali selekcijski pritisk in tako omogočili populaciji, da se na spremembo stopenjsko prilagodi. Avtorji so to dosegli z uvedbo dodatne kopije gena III na AP pod kontrolo inducibilnega promotorja. S tem lahko v določenem času inducirajo od razvijajoče molekule neodvisno izražanje gena III, kar efektivno zniža selekcijski pritisk. To omogoči nabiranje mutacij z, v teh pogojih majhnim, a znatnim vplivom na proliferativno sposobnost, ki pa s časom vodijo do razvoja molekul z dobrimi lastnostmi. V skrajnem primeru močne indukcije fagna populacija preide v stanje t. i. evolucijskega drsa (ang. evolutionary drift), ko nanje ne deluje znaten selekcijski pritisk.

4. NEGATIVNA SELEKCIJA

Za pripravo proteina s spremenjeno aktivnostjo so pripravili modifikacijo metode, pri kateri je prisoten negativni selekcijski pritisk proti prvotni aktivnosti. V idealnem primeru bi bila proliferativna sposobnost faga odvisna od razmerja med želeno in neželeno aktivnostjo. Prisotnost neželene funkcije mora tako zavreti proliferativno sposobnost faga, ozko grlo katere je v metodi PACE nivo pIII. Za to so avtorji uporabili antagonist pIII – mutirano obliko proteina pIII, t. i. N-C83 mutanto. Le ta se vgrajuje v fagne delce kjer povzroči zmanjšanje infektivnosti. Zapis za N-C83 gIII so vstavili v plazmid gostiteljskih celic pod kontrolo P_T7, kar je povzročalo negativno selekcijo RNA polimeraz, ki ta promotor še prepoznavajo.

6. REZULTATI

Iz divjega tipa RNAP T7 so razvili mutanto RNA polimeraze T7 z višjo specifičnostjo za P_T3 napram promotorju P_T7 od w. t. RNAP T7 za P_T7 napram P_T3. Aktivnost razvitih mutant T7 na promotorju P_T3 je bila višja od aktivnost w. t. RNAP T7 na P_T7. Rezultata potrjujeta uspešno aplikacijo usmerjene molekularne evolucije z uporabo predstavljenih novosti.

Viri: Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution (Jacob C. Carlson, Ahmed H. Badran, Drago A. Guggiana-Nilo & David R. Liu; Nature chemical biology 10, 216–222, 2014;

A system for the continuous directed evolution of biomolecules; Kevin M. Esvelt, Jacob C. Carlson and David R. Liu, Nature. 2011 April 28; 472(7344): 499–503.