NeoMineX
Projekt NeoMineX je na iGEM-u leta 2024 predstavila ekipa KULeuven, ki je za projekt bila nagrajena z zlato medaljo s področja bioremediacije.
Uvod
Onesnaženost vodnih virov s težkimi kovinami predstavlja vse večjo okoljsko in javnozdravstveno grožnjo, ki izhaja predvsem iz intenzivne industrializacije in sodobnih antropogenih dejavnosti. Težke kovine, kot so svinec, arzen in živo srebro, so strupene že v sledovih, saj se kopičijo v organizmih in povzročajo resne poškodbe ledvic, jeter ter nevrodegenerativne motnje. Omenjene kovine se lahko najdejo v hrani, ki jo konzumiramo prek onesnažene vode za pitje, kuhanje ali namakanje kmetijskih površin, kar vodi do kontaminacije prehranskih izdelkov. Obstoječe metode za odstranjevanje kovin iz vode so načeloma neučinkovite pri nizkih koncentracijah in lahko povzročajo dodatno onesnaženje, tudi z industrijskega vidika niso najbolj privlačne ker načeloma ne omogočajo praktične ponovne uporabe odstranjenih kovin. Sočasno se svet sooča z naraščajočimi potrebami po kritičnih surovi6nah in tveganjem njihovega primanjkljaja.
Cilj
Rešitev za omenjene izzive ponuja projekt NeoMineX, ki z uporabo pristopov sintezne biologije omogoča selektivno vezavo in recikliranje kovin iz onesnažene vode. Temeljna ideja projekta je omogočiti učinkovito zajemanje kovin tudi pri nizkih koncentracijah, in sicer z vnosom zapisov za proteine (naprav) z visoko afiniteto in selektivnostjo do določenih kovinskih ionov v bakterijske celice. Na ta način ustvarimo biološko orodje za trajnostno čiščenje vod ter ponoven vnos recikliranih kovin v industrijski cikel, s čimer prispevamo k prehodu v krožno gospodarstvo in zmanjšanju okoljskega onesnaževanja.
Eksperimentalno delo
Postopek se je začel z izborom kovin-vezavnih proteinov na podlagi podatkov iz literature, upoštevajoč zanesljivost napovedi strukture v programu AlphaFold, evolucijsko oddaljenost in kompatibilnost v izbrani šasiji (E. coli) ter selektivnost in afiniteto vezave ciljnih kovin. Napoved mest vezave kovinskih ionov je bila izvedena v programu MIB2, ki je omogočila simulacijo vezave kovin v tridimenzionalni strukturi in identifikacijo ključnih proteinskih ostankov v strukturi, za vezavo kovin. Na podlagi teh rezultatov so z orodjem ProteinMPNN izvedli selektivne mutacije, pri katerih so bila ohranjena vezavna mesta, ostale dele pa so mutirali za izboljšanje stabilnosti in afinitete. Ustvarjenih je bilo deset mutiranih različic, katerih strukture so bile ponovno modelirane. Afiniteto so ocenjevali tudi z orodji mebipred, LMetalSite in CheckMyMetal. Izbrane različice so klonirali v E. coli z dvema pristopoma, prilagojenima dolžini zaporedja. Funkcionalne preizkuse so izvedli z analizami toksičnosti in kolorimetrijo za določitev učinkovitosti vezave kovin. Načrtovan je tudi razvoj modela strojnega učenja, ki bo na podlagi knjižnice mutacij, ustvarjene z PCR, podvrženem napakam, prepoznal mutacije, ki izboljšujejo vezavo kovin. Za načrtovanje in ovrednotenje kovin-vezavnih proteinov, je bila sestavljena majhna sintetična knjižnica konstruktov za izražanje E. coli. Uporabljeni sta bili dve ločeni klonirni strategiji glede na dolžino zapisa. Krajši peptidi (manj kot 50 aminokislin) so bili vneseni v ekspresijski vektor pBAD neposredno preko PCR z kompleemntarnimi konci. Pri daljših zaporedjih so najprej s PCR uvedli specifična mesta za restrikcijske encime tipa IIS, nato pa izvedli sestavljanje z Golden Gate kloniranjem. Načrt začetnih oligonukleotidov je temeljil na ustvarjanju standardiziranih previsov za usmerjeno sestavljanje. Tališča začetnih oligonukleotidov in njihova komplementarnost so bila zoptimizirana, da bi zagotovili čim bolj specifično prileganje. Za ekspresijski sistem so izbrali plazmid pBAD_sfGFP, ki vsebuje promotor pBAD, inducibilen z arabinozo in zapis za zeleni fluorescenčni protein (sfGFP), kar je omogočilo kvantifikacijo izražanja prek fluorescence. pBAD tudi vsebuje zapis za odpornost proti kanamicinu, kar je omogočilo selekcijo v gostiteljskih bakterijah. Po ligaciji zapisov za kovin-vezavne peptide ali proteine in plazmid pBAD_sfGFP so dobili knjižnico vektorjev, katerih je splošna shema izgledala tako:
naprave za peptide (<50 aminokislin): minimalni promotor pBAD (BBa_K2442101) – zapis za sfGFP (BBa_K3202005) – zapis za kovin-vezavni peptid
naprave za proteine: minimalni promotor pBAD (BBa_K2442101) –azpis za sfGFP (BBa_K3202005) – linker (BBa_K2382012) –zapis za kovin-vezavni protein
Po transformaciji v E. coli DH10B je sledil PCR na osnovi kolonije, da bi potrdili obstoj plazmidov v bakterijah. Iz pozitivnih klonov so izolirali plazmide in jih preverili s Sangerjevim sekvenciranjem. Za oceno sposobnosti vezave kovin in toksičnosti kovin na bakterijske celice so bili izvedeni trije komplementarni testi. Prvi je bil test na agarju z gradientom koncentracije kovinskih ionov, ki je omogočil kvalitativno oceno preživetja in rasti celic v prisotnosti kovin, kot sta baker, nikel in cink. Fluorescenca kolonij je posredno nakazovala izražanje konstrukta in stabilnost proteina v danih pogojih. Drugi je bil kvantitativni test toksičnosti kovin v tekočem mediju, kjer so z merjenjem optične gostote pred in po izpostavitvi kovinskim ionom ocenili vpliv izraženih proteinov na rast celic. Pripravili so ploščo s 96 vdolbinicami, koncentracija kovinskega iona je po vrsticah naraščala, razpon koncentracije je bil od 10 do 1000 mg/L. Prekonočne kulture so redčili, da optična gostota (OD600) znaša 0,2. Dodali so arabinozo, da se sproži izražanje vstavljenih zapisov in so take kulture dali inkubirati za še 3 ure. Inkubaciji je sledila redčitev do 1000 celic/mL ter nanos 100 µL kulture v posamezno vdolbinico na plošči. Po inkubaciji so spet izmerili OD600. Tretji test je vključeval spektrofotometrično kvantifikacijo nevezanih kovinskih ionov v supernatantu po iniciaciji izražanja kovin-vezavnih peptidov in inkubaciji bakterijskih celic v raztopinah kovinskih ionov. Z uporabo specifičnih kromogenih reagentov, kot so 2,2'-bikinolin in tiocianat, so izmerili koncentracijo nevezanih kovin, kar je omogočilo oceno afinitete izraženih proteinov do teh ionov. Za analizo polimerizacije proteinov so pripravili fuzije zapisa za sfGFP z zapisoma za SpyTag na obeh koncih ter zapisa za mCherry z dvema zapisoma za SpyCatcher. Po transformaciji in liziranju celic so lizate zmešali, prisotnost in velikost monomerov ter povezovanje v polimere so preverili z NaDS-PAGE in merjenjem fluorescence pri 473 nm.
Rezultati
Pri izbiri in kloniranju kovin-vezavnih peptidov in proteinov so uspešno klonirali 28 od 34 izbranih. Točkovne mutacije, ki so nastale med PCR, so uspešno odpravili z uporabo metode mestno specifične mutageneze. Poleg kovin-vezavnih proteinov, so uspešno klonirali fuziji SpyTag-sfGFP-SpyTag in SpyCatcher-mCherry-SpyCatcher, ki medsebojno tvorita polimere. Gradientne teste na agarju so sprva izvajali z enkratnim nanosom bakterij po površini agarja, kar pa se je po inkubaciji izkazalo kot nezadostno robusten sistem, saj je bila količina nanesenih bakterij vzdolž linije neenakomerna. Zato so test prilagodili tako, da so bakterije nanašali v točkah – v enakomernih intervalih in z enako količino bakterij – kar je omogočilo bolj primerljivo in konsistentno ocenjevanje rasti. Ta izboljšana metoda se je izkazala za bolj zanesljivo in je omogočila lažjo interpretacijo rezultatov. Točkovni test so izvedli za ione Cu²⁺, Ni²⁺ in Zn²⁺. Na agarju s Cu²⁺ in Ni²⁺ so največjo odpornost pokazale kolonije z izraženima proteinoma ModA in PbrR. Testi z Zn²⁺ niso prinesli zaključnih rezultatov, saj so bile uporabljene koncentracije prešibke, da bi zavirale rast kolonij. Kvantitativni test toksičnosti Cu²⁺ v tekočem mediju je pokazal izrazit padec vrednosti OD600 v območju koncentracij med 100 in 200 mg/L, kar kaže na množično celično smrt zaradi toksičnega učinka bakra. V kolorimetričnem testu za Cu²⁺ so iz umeritvene krivulje in izmerjenih absorbanc izračunali odstotek odstranjenih ionov po eni uri inkubacije, pri začetni koncentraciji 50 mg/L. Peptidi P3, Ag4, J140, GaPept, GBP1, CDS7, SmtA, MymT, MT-SYNSP, HRMBP, CSP1, ModA, Azurin, SilE in CSP1.3 so pokazali višjo kapaciteto odstranitve Cu²⁺ kot kontrolne celice s praznim plazmidom pBAD. Največjo stopnjo odstranitve (približno 50 %) so dosegli vzorci z GaPept in CDS7. Ker jim ni uspelo sklonirati kobalt-vezavnih peptidov, testov za Co²⁺ niso mogli izvesti.
Zaključek
Projekt NeoMineX se osredotoča na biološko odstranjevanje težkih kovin iz odpadnih vod z uporabo gensko spremenjenih bakterij E. coli, ki izražajo kovin-vezavne peptide in proteine. Ti proteini učinkovito vežejo kovinske ione, kot so Cu²⁺, Ni²⁺ in Zn²⁺, kar omogoča njihovo odstranitev tudi pri nizkih koncentracijah. Eksperimenti so pokazali izboljšano preživetje sevov pod kovinskim stresom ter povečano učinkovitost odstranjevanja kovin. Kljub omejenemu obsegu projekta in določeni variabilnosti v rezultatih in meritvah projekt kaže velik potencial za reševanje okoljskih problemov globalnega obsega.
