Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši
Staphylococcus aureus
Safilokokni enterotoksin B (SEB) proizvaja bakterija Staphylococcus aureus. S. aureus je po Gramu pozitivna bakterija, krogličaste oblike, ki jo pogosto kot del naravne flore najdemo v nosni votlini, respiratornem traktu in na koži. Je fakultativni anaerob, kar pomeni, da lahko živi in se razmnožuje brez prisotnosti kisika. SEB je eden najpogostejših eksotoksinov, ki v telo vstopa z zaužitjem ali inhalacijo. SEB povzroči kožne infekcije kot so mozolji, turi, ognojki, celulitis in tudi življenjsko ogrožajoča bolezenska stanja kot je meningitis, pljučnica, osteomielitis, endokarditis, sepsa in sindrom toksičnega šoka. Zaradi prekomerne in napačne uporabe antibiotikov S. aureus razvija odpornost in pojavlja se MRSA (ang. methicillin-resistant S. aureus), ki predstavlja velik problem v klinični medicini. Drug problem pa je možna uporaba SEB v bioteroristične namene. SEB zaradi toksičnosti, infektivnosti in odpornosti proti številnim okoljskim dejavnikov kot so vročina, proteolitska degradacija, spremembe v pH spada v kategorijo B potencialnih bioterorističnih agensov. Proti bakteriji S. aureus še ne uporabljamo učinkovitih cepiv, s katerimi bi omejili celoten spekter okužb.
STAFILOKOKNI ENTEROTOKSIN
SEB je enoverižni protein, velik 28 kDa, sestavljen iz 240 aminokislin, ki tvorijo dve domeni. SEB se veže direktno na MHC II molekule, ki so predstavljene na površini antigen prezetirajočih celic. Kompleks SEB-MHC II se nato veže na Vβ verigo T-celičnega receptorja (TCR). Kompleks treh molekul predstavlja signal za izločanje citokinov iz T-celic (IFN-γ, interlevkin-2, TFN-α). Prekomerno izločanje citokinov povzroči citokinsko nevihto in posledično sindrom toksičnega šoka. Če bi uspeli preprečiti tvorbo kompleksa bi lahko preprečili toksičen učinek SEB. Tvorbo kompleksa lahko preprečimo z mestno-specifično mutacijo aminokislin, ki so ključne za tvorbo kompleksa. Primer je cepivo STEBVax, ki je trenutno v prvi fazi kliničnih testiranj in predstavlja molekulo SEB z mutacijami L45R, Y89A in Y95A. Cepivo ne škoduje sistemu, ampak le inducira proizvodnjo protiteles, ki ščitijo pred boleznimi, ki jih povzroča divji tip toksina (wtSEB). Znanstveniki iz članka so predstavili nove možne kandidate za učinkovito cepivo proti okužbam s SEB. Pripravili netoksične mutante SEB (mSEB), ki so po tretiranju kulture sprožili imunski odziv (S2, S9, S19 in S26). Za kontrolo so uporabljali prav STEBVax (rSEB).
PRIPRAVA NETOKSIČNIH MUTANT SEB
S pomočjo informacij iz PDB datoteke in zaporedja toksina iz podatkovne baze GenBank so izvedli substitucijo pomembnih aminokislinskih ostankov z alaninom. Mutirana zaporedja so nato vnesli v vektor pET-28a in transformirali celice E. coli. S pomočjo Ni-NTA kolone so izolirali proteine mSEB in produkte analizirali na 12 % SDS-PAGE.
IMUNIZACIJA
S prenosom western so potrdili imunološko reaktivnost med mSEB in poliklonskimi anti-rSEB protitelesi, ki so jih pridobili iz miši po imunizaciji z rSEB. Z uporabo mišjih celic vranice in inkubacijo z različnimi koncentracijami wtSEB in mSEB so s pomočjo testa ELISA preverili kateri mSEB inducirajo superantigensko aktivnost (povečano izločanje citokonov) in te izločili iz nadaljnjega testiranja (S2). Prav tako so s testom ELISA izmerili količino izločenih citokinov in vivo, po predhodni imunizaciji miši. V miš so injicirali med 10 in 20 μg mSEB, trikrat, v obdobju šestih mesecev in potrdili povečano prisotnost protiteles IgG. Sledila je analiza izotipov izločenih IgG, ugotovili so, da je povečana produkcija IgG1 in IgG3, kar potrjuje, da se zaradi vpliva mSEB aktivirajo T celice pomagalke tipa 1 in tipa 2. En teden po končni imunizaciji miši, so miši okužili z wtSEB in opazovali delež preživetja. 100 % imuniziranih miši z mSEB S9 in S19 je preživelo.
ZAKLJUČEK
Raziskava ponuja zelo primerne kandidate za cepivo, ki bi jih pri tako širokem spektru bolezni, ki jih povzroča S. aureus lahko uporabili le za preprečevanje sindroma toksičnega šoka ali podobnih bolezni, ki so posledica prekomernega izločanja citokinov kot odziv na okužbo z SEB.
VIRI
[1] Staphylococcus Aureus Infection, http://emedicine.medscape.com/article/971358-overview, citirano: 14.4.2017, [2] Choi J. Y., Shin S., Kim N. Y., Son W. S., Kang J. T., Song D. H., Yu C. H., Hur G. H., Jeong S. T., Shin Y. K., A novel staphylococcal enterotoxin b subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model. Toxicon, 131 (2017), 68–77.
