Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

UVOD

Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas. Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kar je sicer značilno za evkarionte.

ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV

HORIZONTALNI PRENOS GENOV

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material Escherichie coli v Salmonello Typhimurium. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s pre-stresanjem z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije Streptococcus thermophilus za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev Streptococcus thermophilus DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [1]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [2]). Iz mutanta WT_Φ858^+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WT_Φ2972^+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WT_Φ858^+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WT_Φ858^+S1S2 izbrisali gen cas5 ali cas7. Bakterija z izbrisanim genom cas5 ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom cas7 pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

RAZISKAVA O OMEJITVI HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV Z DELOVANJEM ZAPOREDJA CRISPR NA PLAZMIDNO DNA

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij Staphylococcus aureus, rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij Staphylococcus epidermis. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR spcI pri S. epidermis z zaporedjem nes (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi cas), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu S. epidermis brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev S. aureus RN4220. Da bi dokazali, da spc1 preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v nes zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z nes, ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis nes, temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) nes mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo nes na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

VIRI IN LITERATURA

• M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
• B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
• R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
• R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
• L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.