Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji
Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. Of CO2urse. Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.
UVOD
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. CO2 Acceleration. Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. Overview of Greenhouse Gases. Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sinteznobiološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].
PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA
Of CO2urse
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami E. coli, v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].
Priprava E.coli, ki fiksira CO2
Za pripravo CO2-fiksirajoče E.coli so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - Synechococcus elongatus PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, s sod. Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation. Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v E.coli omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve E.coli - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo E.coli BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost E.coli pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].
Potek nove presnovne poti v E.coli
Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].
Učinkovitost izrabe CO2 v E.coli
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu E.coli sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni E.coli pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. CO2 bypass pathway). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase E.coli ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].
Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. xylose utilisation index) – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi E.coli in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici E.coli stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 stalna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip E.coli lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna E.coli pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sinteznobiološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne E.coli 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].
Oblikovanje bioreaktorja
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sinteznobiološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so E.coli, ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].
Programska oprema bioreaktorja
Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].
Biovarnost
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].
ZAKLJUČEK
Ekipa je razvila sinteznobiološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. Straw-degrading Energy E.coli. Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, s sod. Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli. Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko E.coli gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways. PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.
VIRI
<references/>
