PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih

PETEXE je iGEM projekt iz leta 2019, katerega avtorji so podiplomski študentje iz Univerze v Exeterju, Anglija. Cilj projekta je bil razrešiti problem kopičenja mikroplastike v oceanih z izdelavo filtracijskega sistema za pralne stroje na osnovi encimov, ki razgrajujejo poliestre.

Spletna stran projekta PETEXE, iGEM 2019, Exeter: https://2019.igem.org/Team:Exeter

Avtorica povzetka: Lana Vogrinec

Mikroplastika

Plastika je širok pojem, ki opisuje več vrst sorodnih polimernih materialov. Za človeka najuporabnejši plastični materiali so polipropilen, polietilen, polivinil klorid, polistiren in polietilen tereftalat. Prva odkritja plastike segajo v 19. stoletje, največji razvoj pa so tovrstni materiali doživeli v začetku 20. stoletja<ref> A. L. Andrady, M. A. Neal: Applications and Societal Benefits of Plastics. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 2009, 364, 1977–1984.</ref>. Kljub raznovrstnim lastnostim in nepogrešljivosti plastičnih materialov, pa ima njena množična uporaba tudi negativne posledice. Med njimi je najbolj očitna nalaganje plastičnih izdelkov v okolju. Zaradi počasne razgradnje lahko tovrstni izdelki v okolju ostanejo več desetletij ali celo stoletij<ref>H. Webb, J. Arnott, R. Crawford, E. Ivanova: Plastic Degradation and Its Environmental Implications with Special Reference to Poly(Ethylene Terephthalate). Polymers (Basel). 2012, 5, 1–18.</ref>, še večji problem pa predstavljajo majhni vmesni produkti razgradnje, ki jih opišemo s pojmom mikroplastika. To so delci plastike, ki v dolžino merijo manj kot 5 mm in se najpogosteje kopičijo v vodah<ref>A. Collignon, J.-H. Hecq, F. Galgani, F. Collard, A. Goffart: Marine Pollution Bulletin Annual Variation in Neustonic Micro-and Meso-Plastic Particles and Zooplankton in the Bay of Calvi (Mediterranean-Corsica). 2014, 79, 293–298.</ref>. Ocenjuje se, da naj bi bilo v svetovnih oceanih med 15-51 bilijonov mikroplastičnih delcev<ref>E. van Sebille, C. Wilcox, L. Lebreton, N. Maximenko, B. D. Hardesty, J. A van Franeker, M. Eriksen, D. Siegel, F. Galgani, K. Lavender Law: A Global Inventory of Small Floating Plastic Debris. Environ. Res. Lett. 2015, 10.</ref>, človek pa naj bi na račun tega tedensko zaužil kar do 5 g plastike<ref>K. Senathirajah, T. Palanisami. How Much Microplastics Are We Ingesting? Estimation of the Mass of Microplastics Ingested. 6. 11. 2019. [citirano 9. 4. 2020.] https://www.newcastle.edu.au/newsroom/featured/plastic-ingestion-by-people-could-be-equating-to-a-credit-card-a-week/how-much-microplastics-are-we-ingesting-estimation-of-the-mass-of-microplastics-ingested</ref>.

Mikroplastika v modni industriji

Modna industrija je eden izmed največjih virov onesnaženja oceanov z mikroplastiko. Vzrok za to je vse pogostejša uporaba poliestrskih in drugih plastičnih materialov v tekstilnih izdelkih. Zaradi hitro se menjujočih modnih izdelkov na trgu se oblačila iz plastičnih materialov kopičijo na odpadih, še večji vir onesnaženja pa so mikroplastični delci, ki se izločijo skupaj z odpadno vodo med pranjem takšnih tekstilov. Tekom enega pranja naj bi se tako sprostilo med 124-308 mg plastičnih vlaken na kg opranega perila<ref>F. De Falco, E. Di Pace, M. Cocca, M. Avella: The Contribution of Washing Processes of Synthetic Clothes to Microplastic Pollution. Sci. Rep. 2019, 9, 1–11</ref>. Zaradi uporabnosti in nizke cene poliestra je malo verjetno, da bo v prihodnosti raba tega materiala v modni industriji upadla. Zato je bil cilj projekta PETEXE razvoj alternativne metode za odstranjevanje plastičnih vlaken, ki nastajajo ob pranju oblačil.

Projekt PETEXE

Osnovna ideja članov skupine projekta PETEXE je bila razviti sistem za učinkovito filtracijo mikroplastičnih vlaken, ki nastajajo ob pranju perila v pralnih strojih. Projekt so razdelili na dva dela: izdelavo mehanskega filtra in pridelavo encimov za razgradnjo plastike s sinteznobiološkim pristopom. Znotraj slednjega so si zastavili iskanje in optimizacijo encimov za razgradnjo polietilen teraftalat (PET), ki spada v skupino poliestrov<ref>Polyethylene terephthalate: Structure, Properties, & Uses. Britannica. 25. 7. 2018. [citirano 9. 4. 2020.] https://www.britannica.com/science/polyethylene-terephthalate.</ref>. Končen produkt naj bi bil sestavljen iz filtra, ki bi ujel mikroplastična vlakna iz vode ob pranju perila, in encimskih komponent, ki bi omenjena vlakna razgradila in situ.

Encimi za razgradnjo PET-a

PET je močan, mehansko stabilen in precej odporen polimer, ki dobro prenaša kemijsko in toplotno razgradnjo<ref>S. Venkatachalam, S. G. Nayak, J. V Labde, P. R. Gharal, K. Rao, A. K. Kelkar: Degradation and Recyclability of Poly (Ethylene Terephthalate). 2012.</ref>. V naravi je bilo odkritih nekaj encimov, ki imajo ob svoji osnovni encimske aktivnosti tudi sposobnost razgradnje PET-a. Primer takšnega encima je kutinaza iz bakterije Thermobifida alba<ref>D. Ribitsch, E. H. Acero, K. Greimel, I. Eiteljoerg, E. Trotscha, G. Freddi, H. Schwab, G. M. Guebitz: Characterization of a New Cutinase from Thermobifida Alba for PET-Surface Hydrolysis. In Biocatalysis and Biotransformation; Taylor & Francis Group. 2012, 30, 2–9.</ref>. Encimska razgradnja PET-a poteka v dveh korakih. Najprej se PET razgradi na mono-2-hidroksietil tereftalat (MHET), bis(2-hidroksietil)tereftalat (BHET) in tereftalično kislino (TPA). MHET se lahko nato dalje razgradi do TPA in etilen glikola (EG). Encima, ki razgrajujeta izključno PET in MHET, sta bila odkrita leta 2016 v bakteriji Ideonella sakaiensis in sta bila produktom ustrezno poimenovana PETaza in MHETaza. Za razgradnjo na osnovne enote, ki so neškodljive za okolje, sta potrebna oba<ref>S. Yoshida, K. Hiraga, T. Takehana, I. Taniguchi, H. Yamaji, Y. Maeda, K. Toyohara, K. Miyamoto, Y. Kimura, K. Oda: A Bacterium That Degrades and Assimilates Poly(Ethylene Terephthalate). Science (80-. ). 2016</ref>. Encima za razgradnjo BHET-a v naravi niso odkrili, pokazano pa je bilo, da se z uvedbo določenih mutacij MHETazna aktivnost spremeni v BHETazno<ref>G. J. Palm, L. Reisky, D. Böttcher, H. Müller, E. A. P. Michels, M. C. Walczak, L. Berndt, M. S. Weiss, U. T. Bornscheuer, G. Weber: Structure of the Plastic-Degrading Ideonella Sakaiensis MHETase Bound to a Substrate. Nat. Commun. 2019, 10, 1–10.</ref>.

Načrtovanje konstruktov

Načrt članov projekta PETEXE je bil sintetizirati vse encime, potrebne za dokončno razgradnjo PET-a na osnovne, neškodljive enote. Za izhodišče so vzeli PETazo in MHETazo iz bakterije Ideonella sakaiensis, prav tako pa so želeli pripraviti tudi encim z BHETazno aktivnostjo, ki bi zaključil pot razgradnje. V začetku so se izdelave lotili iz dveh smeri, in sicer s pripravo sevov E. coli, ki bi encime izločali v okolico ter z izolacijo čistih rekombinantnih proteinov. Temu ustrezno so pripravili več različnih konstruktov.

Vsi pripravljeni konstrukti so vsebovali inducibilen T7 promotor, RBS, terminator in N-končno heksahistidinsko oznako (6xHis). Set konstruktov za zunajcelično izražanje so pripravili z združitvijo sintetiziranih genov, promotorja, RBS-ja in terminatorja v vektorju pX1800 s kloniranjem na podlagi tipa IIs restriktaz. Tovrstni konstrukti so vsebovali tudi enega izmed signalnih peptidov, lamB ali malE, za zunajcelično lokalizacijo. Set konstruktov za znotrajcelično izražanje in nadaljnje čiščenje je za njih v celoti sintetiziralo podjetje TWIST v vektorju pET28.

Konstrukti znotraj posameznih setov so se med seboj razlikovali v kodirajoči regiji in po uporabljenem signalnem peptidu v primeru konstruktov za zunajcelično izražanje. Namen izražanja različnih kodirajočih regij encimov je bil poiskati takšne, ki bi imeli večjo aktivnost in termično stabilnost v primerjavi z divjimi tipi. V osnovi so kodirajoče regije razdelili na tri skupine: PETaze, MHETaze in BHETaze. Znotraj skupine PETaz so kandidate za konstrukte poiskali na dva načina: z upoštevanjem predhodno testiranih mutacij, objavljenih v literaturi, in z metodo rekonstrukcije prednikov. V skupini MHETaz so prav tako znane mutacije za povečanje učinkovitosti, navedene v literaturi. BHETaze so pripravili z uvedbo dveh kombinacij mutacij, za katere je znano, da spremenijo MHETazno aktivnost v BHETazno.

Registrirane biokocke

V okviru projekta PETEXE so člani skupine v sinteznobiološki register deponirali 22 novih biokock. Razdelili so jih v štiri kategorije: PETaze, pridobljene z uvedbo mutacij iz literature (8); PETaze, pridobljene z metodo rekonstrukcije prednikov (4), MHETaze (5) in BHETaze (4). Biokocke ustrezajo zgoraj opisanim konstruktom in se med seboj razlikujejo samo v kodirajoči regiji ter v regiji signalnega peptida. Vse biokocke imajo optimizirano rabo kodonov za E. coli, sev K12.

Sinteza encimov

Za izražanje so uporabili E. coli, sev Arctic Express. Izmed opisanih konstruktov so uspešno izrazili dva encima z BHETazno aktivnostjo, BHETazo 1 z mutacijama S416A in F424N (BBa_K3039005) in BHETazo 2 z mutacijami R411A, S419G in F424N (BBa_K3039006). BHETazi so izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo, niso pa ju uspeli očistiti z gelsko izključitveno kromatografijo. Uspešno so sintetizirali štiri PETaze iz konstruktov, pridobljenih z uvedbo mutacij iz literature: PETazo S121E_D186H_R280 (BBa_K3039003), PETazo R280A (BBa_K3039000), PETazo T88A_S121E_D186H_R280A (BBa_K3039001) in PETazo T88A_S93M_S121E_W159F_D186H_R280A (BBa_K3039002). Imena PETaz se nanašajo na mutacije, ki so bile uvedene. Prav tako so uspešno sinetizirali štiri PETaze, pridobljene z rekonstrukcijo prednikov (PETaza 1: BBa_K3039017, PETaza 2: BBa_K3039018, PETaza 3: BBa_K3039019, PETaza 4: BBa_K3039020). Vseh osem PETaz so uspešno izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo in očistili z gelsko izključitveno kromatografijo. Pri izražanju MHETaznih konstruktov niso bili uspešni, saj nobene izmed MHETaz niso mogli izolirati v dovolj velikih količinah za nadaljnja testiranja.

Testiranje učinkovitosti

V sklopu testiranja učinkovitosti pridobljenih encimov so želeli preveriti njihovo encimsko aktivnost in termično stabilnost ter jih primerjati z lastnostmi divjih tipov, iz katerih so izhajali. Encimsko aktivnost so preverili z esteraznim testom in testom encimske razgradnje mikroplastičnih vlaken, izoliranih iz filtra pralnega stroja.

BHETaze

Esterazni test za BHETaze so izvajali s čistim substratom BHET, pri čemer so encim v treh različnih koncentracijah (250, 500 in 1000 µM) inkubirali s substratom 24 ur pri 30 °C. Učinkovitost encima so preverili z merjenjem koncentracije produktov razgradnje (BHET, MHET in TPA) s HPLC-jem. V primeru obeh BHETaz so ugotovili, da se z večanjem koncentracije encima veča koncentracija MHET-a in zmanjšuje koncentracija BHET-a. To je v skladu s pričakovanji in potrdi hipotezo, da z uvedbo omenjenih mutacij encim z MHETazno aktivnostjo pridobi BHETazno aktivnost. Primerjave učinkovitosti z divjim tipom niso možne, saj izhodiščni encim nima BHETazne aktivnosti. Testa učinkovitosti razgradnje na mikroplastičnih vlaknih in testa termične stabilnosti na BHETazah niso izvedli oziroma rezultati niso prikazani.

PETaze

Esterazne teste za PETaze so izvajali s substratom p-nitrofenol acetatom, pri čemer so aktivnost spremljali spektrofotometrično pri 405 nm z merjenjem sproščenega p-nitrofenola. Prav tako so aktivnost PETaz preverili na mikroplastičnih vlaknih z različnimi koncentracijami encima (50-2000 µM). Encime so z vlakni inkubirali 76 ur in nato preverili koncentracije produktov razgradnje s HPLC-jem. Termično stabilnost so preverili z enourno inkubacijo encimov pri temperaturah med 20 in 90 °C. Izmed vseh PETaz je pri vseh testih najboljše rezultate dosegla PETaza S121E_D186H_R280. Učinkovito je razgradila substrat v različnih koncentracijah in izkazala večjo termično stabilnost kot preostale PETaze in PETaza divjega tipa. Prav tako je uspešno razgradila mikrovlakna PET-a.

Zaključek

Cilj projekta PETEXE je bil spopasti se s težavo prekomernega kopičenja mikroplastike, katere primarni vir so oblačila iz poliestrskih materialov, ki ob pranju v vodo sproščajo mikroplastična vlakna. Njihova ideja je temeljila na filtrirnem sistemu, ki bi ob mehanskem zajemanju vlaken le-ta še encimsko razgradil in s tem onemogočil njihovo nalaganje v vodah. Kljub uspešni pripravi encimov z zmožnostjo razgradnje PET-a in mehanskega filtrirnega sistema, pa študentom tekom projekta ni uspelo proizvesti končnega izdelka z združitvijo obeh komponent.

Viri

<references/>