PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike

PET TWINS – The way to implementation success [1] je projekt, s katerim je ekipa Waseda-Tokyo na področju bioremedicacije leta 2024 dosegla prvo mesto v kategoriji dodiplomskih študentov. Prejeli so tudi nagrado za najboljši kompozitni del ter nagrado za integrirane človeške prakse.

Uvod

Količina plastike in njena reciklaža je na Japonskem eden izmed večjih problemov. Ker je nemogoče, da bi mikroplastiko v okolju v celoti odstranili, je ekipa želela zmanjšati njen prehod v okolje z zmanjšanjem količine iz odpadne plastike nastale mikroplastike. Trenutno je najbolj uporabljena metoda reciklaže termična obdelava oz. sežiganje, kjer pa se sproščajo velike količine CO2. Kemično recikliranje prinaša isto težavo z dodatno potrebo po kemikalijah. Pri materialnem recikliranju gre za drobljenje odpadne plastike in segrevanje ter nastajanje peletov, iz katerih naredijo nove plastične izdelke. 25 % odvržene plastike predstavlja kompozitna plastika, sestavljena iz večih vrst mikroplastike, njena obdelava pa je težavna predvsem zaradi razlik v temperaturi taljenja posameznih materialov. PET oz. polietilen tereftalat s svojo robustno kemično strukturo in visoko temperaturo tališča zmanjšuje učinkovitost recikliranja ostale plastike v kompozitih ter kakovost nastalih peletov. Študije postopka razgradnje PET-a z encimom PETazo so bile že objavljene, vendar niso dosegle želene širše uporabe, še posebej majhno v industriji. Prednost PETaze je, da ima večjo specifičnost kot kemijske metode, zato se lahko uporablja v bolj milih pogojih. Poleg tega lahko reagira z bolj finimi delci, ki jih fizični filtratni sistemi prepuščajo. Vendar ima tudi nekaj slabih strani, kot so potreba po čiščenju, posledična slaba stabilnost, težava pri ohranjanju encimske aktivnosti skozi čas in enkratna uporabnost.

Cilj

PET TWINS je PET-razgrajajoči sistem iz dveh modulov; BIND-PETaznega modula in elektro-števnega varnostnega modula ECB. Uporaben je v tovarnah, je ekološki, aktivacija sistema pa je zlahka kontrolirana preko električnih signalov. Uporablja optimizirano PETazo, mobilizirano na Curlijevih vlaknih na membrani E.Coli. S tem lahko encim dostopa do substrata direktno in ni potrebenga čičenja, s čimer se poveča stabilnost in omogoči možnost ponovne uporabe. Sistem je tudi biološko varen, saj po končani funkciji encima omogoči zmanjšanje koncentracije bakterij in s tem zniža njen prehod v okolje. PET TWINS je zastavljen za uporabo v industrijskih obratih za razgradnjo kompozitne plastike, pri čemer bi sam obrat vseboval tri rezervoarje: V prvem bi gojili E. Coli, v drugem bi le-te ob električnem signalu razgrajevale PET, ob ponovnem signalu pa propadle. TPA, ki bi nastal pri razgradnji PET-a, bi se shranil v tretjem rezervoarju, kjer bi se lahko ponovno polimeriziral. Ostala plastika bi se učinkovito razgradila, iz nje bi naredili pelete, ki bi bili ponovno uporabni.

Delovanje

BIP modul

V modulu BIP so naredili fuzijske proteine, imenovane BIND-PETaze in povečali njihovo funkcionalnost. Mutante PETaze so ustvarili z računalniško evolucijo in racionalnim načrtovanjem ter s pomočjo simulacij in laboratorijskih poskusov izbrali najbolj funkcionalno. Izboljšano PETazo so fuzirali za zunajmembranskim faktorjem CsgA, ki na membrani E. Coli polimerizira in tvori Curlijeva vlakna, na katera se lahko encim sidra. Ker so zapis za fuzijski protein CsgA-BIND-PETaza izrazili pod promotorjem pSoxS, ki je električno inducibilen, je razgradnja potekala le ob določeni električni stimulaciji.

ECM modul

Ker je pomembno, da pri biotehnološki uporabi gensko spremenjenih organizmov le-te tudi varno odstranimo iz reakcijske mešanice, so uvedli modul, ki združuje električno inducibilen promotor pSoxS ter sistem Cre/loxP. Z drugim električnim stimulusom so spodbudili nastanek proteina MazF, ki naj bi sprožil celično smrt bakterij.

Sistem deluje tako, da prvi dodatek napetosti povzroči oksidacijo piocianina na elektrodi, ta vstopi v celico in oksidira SoxR. Slednji deluje na promotor pSoxS, ki originalno funkcionira kot del operona v odzivu na oksidativni stres v E.Coli, tu pa promovira transkripcijo rekombinaze Cre. Rekombinaza deluje na DNA sekvenco loxP: zareže v regiji med dvema loxP in s tem ireverzibilno odstrani del DNA, v tem primeru terminator. S tem se spodbudi izražanje BIND-PETaze iz promotorja pCon, prepiše se gen CsgA, nastanejo vlakna, na katera se zunajcelično pripne mutirana PETaza. Ob drugi električni stimulaciji se SoxR spet oksidira, kar spodbudi transkripcijo iz pSoxS, to pa rezultira v izražanju samomorilskega gena MazF, ki onemogoči, da bi E. Coli zašla v čisto okolje. Izražanje MazF ob prvi stimulaciji so preprečili s takojšnjo inhibicijo pSoxS z reverzno napetostjo.

Računalniško delo

Računalniška evolucija

Za izboljšanje funkcionalnosti BIND-PETaz so izvedli računalniško evolucijo PETaz, ki je bila sestavljena iz treh korakov: načrtovanja mutacij preko strojnega učenja, računalniškega presejanja in validacije v laboratoriju. Pri vsakem koraku so ohranili le najbolj obetavne mutante. Pri načrtovanju mutacij s strojnim učenjem so uporabili dva modela, ESM3 in EvoProtGrad. Računalniško presejanje so izvedli glede na podatke o prosti energiji ter stabilnosti in afinitete vezave oz. priklopa PET-a na PETazo. Uporabili so metodi pyRosetta in DockString, pri čimer so si pomagali tudi z mapo elektronske gostote. Izbrali so različice z nizkimi energijskimi vrednostmi, kar je pomenilo, da sta PET in mutirana PETaza vezana stabilnejše. Z uporabo modela EMS3 so določili optimalne PETazne variatne, označene z ID1-5, pri čemer je imela ID1 najnižjo energijo pri priklopu monomernih PET, ID2 dimerov PET in ID3 tetramerov. Z uporabo EvoProtGrad so izbrali dve različici PETaze: ID4 in 5.

Racionalno načrtovanje

Poleg računalniške evolucije so izvedli še racionalno načrtovanje, kjer so kombinirali uporabna encimska mesta drugih proteinov, pri čemer so uporabili informacije o najbolj aktivnih znanih mutantah PETaze – DuraPETazi in DepoPETazi ter encimu LCC, ki prav tako razgrajuje PET, ima večjo afiniteto kot PETaza, strukturno in sekvenčno pa ji je podoben. S poravnavo LCC s PETazo so identificiralai 3 mutacije, ki naj bi povečale aktivnost encima in dizajnirali 3 variante s kombinacijami teh mutacij ter jih validirali glede na povezovanje s PET. Izbrali so tri nove različice ID6-8 ter naredili še en krog dizajna, kjer so uporabili DuraPETazo in DepoPETazo. Mutirali so jih in naredili kombinacije obeh ter izbrali še dodatnih 6 variant ID22-27.

Eksperimentalno delo

Za optimizacijo RBS so najprej uporabili wt PETazo, PETazo z optimizirano rabo kodonov za E.Coli in wt PETazo s 5 aminokislinskimi mutacijami. Potrdili so izražanje in encime funkcionalno validirali. V drugi fazi so 14 z računalniško evolucijo in racionalnim načrtovanjem konstruiranim BIND-PETazam preverili funkcionalnost. Zmožnost tvorbe Curlijevih vlaken so potrjevali s testom z barvilom kongo rdeče, ki rdeče obarva Curlijeva vlakna, hidrolitično aktivnost pa s testom pNPB. Tu so izmerili nastali rumeni para-nitrofenol, vendar je to predstavljalo le enostavno oceno dejanske katalitične aktivnosti. Izmed vseh variant sta se za najbolj obetavni izkazali varianti z oznakama ID 23 in 24, katerih aktivnost so preverili tudi po shranjevanju nekaj tednov pri sobni temperaturi in 4 °C ter po 3-kratni ponovni uporabi. Ocenili so tudi njuno zmnožnost razgrajevanja peletov PET ter praška PET pri pH 7 in 9. Ugotovili so, da MazF sicer zavira razmnoževanje E. coli, vendar jih ne more popolnoma odstraniti ter da je divji tip pSoxS puščajoč promotor, zato bi morali za nadzor izražanja toksičnih proteinov uporabiti mutanta z manjšim puščanjem. Izmed testiranih BIND-PETaz so za najbolj optimalno izbrali BIND-PETazo ID 24, jo poimenovali BIND-bearPETaza ter jo vnesli v register iGEM kot nov kompozitni del BBa_K5436124.

Matematično modeliranje

Ker določenih stvari ni mogoče razumeti z laboratorijskimi poskusi, se je ekipa poslužila modeliranja, pri čemer so ustvarili kar nekaj modelov, ki prej še niso bili dostopni na iGEMU in jih tudi objavili. Potrjevanje z matematičnim modeliranjem so razdelili na dve stopnji. V modelu membranskega transporta so kvantificirali proces zunajceličnega transporta BIND-bearPETaze (izbrane najbolj funkcionalne mutante), v modelu razgradnje PET-a pa so količinsko opredelili učinkovitost encima, pripetega na Curlijeva vlakna. Primerjali so tudi sterilizacijsko energijo v primeru električne in toplotne sterilizacije ter analizirali pogoje za difuzijo piocianina z uporabo CIP metode v treh dimenzijah. Med drugim so potrdili, da promotor aktivira električni impulz, in da je 50 sekund oksidacijske napetosti dovolj, da se aktivirata tako promotor kot rekombinacijski sistem. Prav tako so potrdili, da se Curlijeva vlakna začnejo oblikovati postopoma ter da je proces omejen z majhno verjetnostjo vezave in da se ob delovanju encima dolžina PET zmanjšuje in približuje ničli. Vendar pa zaradi majhnosti predpostavljene vezavne in cepitvene konstante za ta sistem realne simulacije niso mogli izvesti. Elektrosterilizacijo so potrdili za boljšo od termosterilizacije ter predlagali, da se lahko poraba energije zmanjša še s spreminjanjem oblike posode.

Zaključek

Ekipa Waseda-Tokio 2024 je razvila nov encimski sistem, ki omogoča dostopnejšo in učinkovitejšo uporabo PETaze za odstranjevanje mikroplastike iz odpadne plastike. Sistem je biološko varen in uporaben za več encimov, kar zmanjšuje stroške čiščenja encimov in izboljša njihovo priročnost. V laboratorijskih poskusih so potrdili, da ima BIND-bearPETaza večjo hidrolitično aktivnost v primerjavi z drugimi različicami BIND-PETaze, da ne potrebuje čiščenja in jo je mogoče hraniti približno dva tedna ter jo do trikrat ponovno uporabiti. Poleg tega so dokazali, da se lahko BIND-bearPETaza uporablja za razgrajevanje PET iz vsakdanjih plastenk ter da razmeroma učinkovito razgrajuje kompozitno plastiko, kar ji daje potencial za uporabo v industrijskih reciklažnih obratih.

Viri

[1] iGEM WASEDA TOKYO https://2024.igem.wiki/waseda-tokyo/ (pridobljeno 11. apr. 2025).

[2] B. Zhu, Q. Ye, Y. Seo, N. Wei: Enzymatic Degradation of Polyethylene Terephthalate Plastics by Bacterial Curli Display PETase. Environ. Sci. Technol. Lett. 2022, 9, 650–657.