PROSTATUS: Diagnostika raka prostate

PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. Spletna stran projekta:

UVOD

Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.

PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.

OPIS PROJEKTA

PRINCIP DELOVANJA SISTEMA

Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas.

SHERLOCK

SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]

DETECTR

DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]

POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA

Kloniranje

Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu). Naročili so sintetični gen za cas13a, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so temu genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a ter mu dodali restrikcijska mesta EcoRI, XbaI, SpeI in PstI. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256.

Načrtovanje sgRNA

Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]

Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]

Pomnoževanje z metodo RPA

Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo.

V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza.

Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.

Inhibicija aktivnosti RNaz

Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas.

Detekcija cepitve reporterja

Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če ne pride do cepitve reporterja, se ob potovanju po traku reporter zaradi vezave biotina ustavi na kontrolni liniji. Če pa pride do cepitve, reporter potuje prek kontrolne linije in rezultat detektiramo na testni liniji prek vezave anti-FAM protitelesa na sekundarno protitelo.

REZULTATI

Skupina je z nikelj-afinitetno kromatografijo uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a.

Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija.

Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna.

Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.

Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi ali pa je prisotnega preveč reporterja in odvečna količina potuje prek vezavno zasedene kontrolne linije. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.

ZAKLJUČEK

V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne tukaj. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.

VIRI

[1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866

[2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179

[3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240

[4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321