Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje
Phactory<ref>iGEM 2018 team Munich. Phactory. 18.10.2018. [citirano 4.12.2018] http://2018.igem.org/Team:Munich</ref> je študentski projekt ekipe Munich na tekmovanju iGEM 2018. Projekt predstavlja možnost priprave proizvodne linije za terapevtske bakteriofage, ki temelji na brezceličnem transkripcijsko-translacijskem sistemu, in ponuja rešitve za trenutne pomanjkljivosti fagne terapije.
Odpornost proti antibiotikom
Odpornost bakterij proti antibiotikom je aktualen in rastoč problem svetovnega zdravstva, na katerega opozarja tudi svetovna zdravstvena organizacija. Porast smrti in stroškov zdravljenja zaradi bakterijskih okužb bo vztrajal, če ne najdemo alternative antibiotikom. Kljub usmeritvi v razvoj novih protimikrobnih snovi, še vedno primanjkuje varnih in učinkovitih nadomestil za trenutne antibiotike<ref>WHO Reagional Office for Europe. About AMR. [citirano 4.12.2018] http://www.euro.who.int/en/health-topics/disease-prevention/antimicrobial-resistance/about-amr</ref>. Strokovnjaki napovedujejo, da se bo breme odpornosti proti antibiotikom do leta 2050 dvignilo proti 10 milijonom smrti letno ter ekonomske cene 1000 milijard USD.
Fagna terapija
Fagna terapija je metoda, kjer pri zdravljenju bakterijske okužbo uporabimo bakteriofage kot terapevtsko sredstvo. Fagna terapija se je skozi vrsto let uspešne klinične uporabe v Rusiji in Gruziji pokazala kot obetavna alternativa antibiotikom. Bakteriofagi so zelo specifični in okužijo samo določene vrste bakterij, na človeške celice pa nimajo neposrednega vpliva. To pomeni tudi, da ne poškodujejo črevesne mikroflore, kar zmanjša možnost oportunističnih okužb pri zdravljenju. Še ena od pomembnih prednosti fagne terapije je, da se nanjo težje razvije odpornost<ref>Pirnay, J. P., Verbeken, G., Ceyssens, P. J., Huys, I., De Vos, D., Ameloot, C., Fauconnier, A. The Magistral Phage. Viruses, 2018, 10, 64.</ref>. Ena od največjih ovir pred večjo uveljavitvijo fagne terapije je sama proizvodnja bakteriofagov. Trenutne metode so neučinkovite, vodijo do visoke vsebnosti nečistoč, ne omogočajo ustrezne kontrole kakovosti produkta in zahtevajo delo s patogenimi bakterijami.
Phactory
Študenti so želeli problem proizvodnje bakteriofagov rešiti s sinteznobiološkim pristopom. Osredotočili so se na brezcelične transkripcijsko-translacijske sisteme, ki omogočajo izražanje genov in sintezo proteinov in vitro, samo na podlagi dodane DNA. Načrtovali so lastno proizvodno linijo, katere osnovna komponenta bi bil bakterijski celični ekstrakt, ki deluje kot transkripcijsko-translacijski sistem. Okrog celičnega ekstrakta so nato projektirali različne stopnje proizvodnje - od pridobivanja bakteriofagne DNA, do proizvodnje sintetičnih bakteriofagov in enkapsulacije terapevtskega odmerka. S kontrolo kakovosti na posamezni stopnji so sistem optimizirali do najpreprostejše rešitve in se usmerili v dostopnost, prenosljivost, ceno in varnost končnega produkta.
Phactory je bil razvit kot dostopna proizvodna linija, ki proizvaja čiste, točno definirane bakteriofage v klinično relevantnih koncentracijah z uporabo visoko prenosljivih, cenovno dostopnih in modularnih komponent. Phactory potrebuje zgolj 2,5-odstotka proizvodnega volumna v primerjavi s tradicionalnimi postopki in ne zahteva posebne varnostne regulacije.
Priprava celičnega ekstrakta
Komercialno dostopni celični ekstrakti so dragi, domače pripravljeni ekstrakti pa navadno niso dovolj kvalitetni in zanesljivi, da bi zagotavljali ponovljive rezultate. Zato se je skupina odločila optimizirati proizvodnjo lastnega celičnega ekstrakta E. coli, ki bi bil cenovno dostopen in visoko kvaliteten. Na podlagi objavljenih protokolov<ref>Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. 2013, 79. </ref> za pripravo brezceličnih transkripcijsko-translacijskih sistemov so preučili več kot 50 parametrov in optimizirali protokole priprave ekstrakta. Kakovost ekstrakta so spremljali tako na nivoju transkripcije, kot tudi translacije. Transkripcijsko aktivnost so zaznali s prepisovanjem RNA aptamera, ki se hibridizira na komplementarno RNA in je sposoben vezave fluorescenčnega barvila Malachite Green<ref>Kolpashchikov, D. M. Binary malachite green aptamer for fluorescent detection of nucleic acids. J. Am. Chem. Soc. 2005, 36, 127, str. 12442-12443.</ref>. Translacijsko aktivnost pa so spremljali preko sinteze fluorescenčnega proteina mTurquoise.
Liza bakterijskih celic
Kot najboljši pristop k lizi bakterijskih celic se je izkazala obdelava z ultrazvokom, dodatek lizocima pa je še povečal sintezno sposobnost ekstrakta. Bakterijsko kulturo so poskusno gojili v biorektorju in potrdili enostavno možnost povečanja obsega proizvodnje. Sintezna aktivnost celičnega ekstrakta je bila sicer nižja kot pri stresalnih erlenmajericah, so pa sklepali, da bi se to dalo izboljšati s prilagoditvijo lize.
Inaktivacija RecBCD
Celični ekstrakt so dodatno poskušali izboljšati z inaktivacijo bakterijske helikaze in nukleaze RecBCD. Gre za encim, ki skrbi za integriteto bakterijske genomske DNA, poleg tega pa lahko razgrajuje eksogeno DNA. Aktivnost RecBCD je mogoče s cis-delujočim DNA zaporedjem Chi preusmeriti tako, da ne razgrajuje eksogene DNA. Kljub vnosu heksamera Chi6 v bakterijske celice, je bila tuja DNA v ekstraktu stabilna zgolj 10 min več, preden se je razgradila.
Liofilizacija
Z liofilizacijo lizata so uspeli izboljšati skladiščenje ekstrakt. Če so liofilizat rehidrirali v vodi brez nukleaz, se je povrnila večina sintezne aktivnosti ekstrakta. S tem so omogočili enostavno prenosljivost in shranjevanje produkta, ki je tako pripravljen za sintezo terapevtskih bakteriofagov kar na licu mesta.
Proizvodnja sintetičnih bakteriofagov
Celični ekstrakt lahko uporabimo kot platformo za sestavljanje bakteriofagov, kjer za osnovo uporabimo bakteriofagno DNA ali RNA. Proces poteka neodvisno od patogenega mikroorganizma, za razliko od tradicionalnih metod priprave. Z uporabo celičnega ekstrakta, očiščene bakteriofagne DNA in inhibitorja nukleaze RecBCD (proteina GamS) se v nekaj urah lahko sestavi terapevtsko relevantna količina bakteriofagov. Sistem potrebuje določene komponente, da deluje normalno - ATP, GTP, NAD+, aminokisline, tRNA, idr. Te spojine lahko v reakcijo vnesemo kot del reakcijskega pufra.
S celičnim ekstraktom so študenti uspešno sintetizirali bakteriofage MS-2, T4, T7, CLB-P2, GEC-3S, ki lahko okužijo različne seve E. coli, tudi terapevtsko relevantne. Titer in aktivnost sestavljenih bakteriofagov so določali s testom plakov na E. coli. Doma pripravljeni celični ekstrakti so dosegali primerljive titre bakteriofagov v primerjavi s komercialno dostopnim celičnim ekstraktom myTXTL.
Modularna sestava bakteriofagov
Bakteriofagi so sestavljeni modularno iz več proteinov in nukleinske kisline. Sestavljanje bakteriofagnih delcev poteka spontano okrog nukleinske kisline, kar lahko v brezceličnem sistemu izkoristimo za spreminjanje bakteriofagnih proteinov brez spreminjanja dedne osnove. V reakcijo sestavljanja bakteriofagov lahko dodamo modificirane proteine in naravno prisotno gensko osnovo, da dobimo bakteriofage, ki niso gensko spremenjeni
Za dokaz koncepta so v E. coli BL21 sintetizirali modificiran protein His-TEV-YFP-HOC, kjer je HOC protein kapside bakteriofaga T4. Očiščen fuzijski protein so dodali v celični ekstrakt skupaj z DNA bakteriofaga T4. Sestavljene bakteriofage z modificiranim HOC so izolirali z Ni-afinitetno kromatografijo ter z njimi okužili bakterijske celice. Okužbo so zaznali fluorescenčno in potrdili, da je s celičnim ekstraktom mogoče pripraviti bakteriofage z modificiranimi proteini.
Kontrola kakovosti
Kontrola kakovosti zagotovi varno in učinkovito aplikacijo terapevtskega sredstva. Pri Phactory je kontrola kakovosti pokrivala več dejavnikov proizvodnje bakteriofagov, predvsem funkcionalnost bakteriofagov, prisotnost bakterijskih endotoksinov in čistost DNA. Funkcionalnost bakteriofagov so na primer preverjali s testom s plaki.
Endotoksini
Endotoksini so pirogeni, ki izhajajo iz gramnegativnih bakterij, in jih je potrebno odstraniti iz farmacevtskih produktov. Vsebnost endotoksinov so določali s testom LAL, pri katerem se uporablja lizat amebocitov atlantskega ostvarja. V prisotnosti lipopolisaharidov pride v lizatu do odziva, ki ga je skupina spremljala kolorimetrično s komercialnim kompletom reagentov. Študenti so pripravili sev bakterije E. coli z izbitim genom msb-B. Gen kodira za miristoiltransferazo, ki sodeluje v biosintezi lipida A, ključnega imunogenega dela lipopolisaharidov. Celični ekstrakt tega seva je vseboval kar 49-krat manjšo koncentracijo endotoksinov in bi se zato lahko uporabljal za proizvodnjo terapevtskih bakteriofagov, ki jih ne bi bilo potrebno dodatno čistiti.
Čistost bakteriofagne DNA
Študenti so bakteriofage pripravljali na osnovi bakteriofagne DNA, ki so jo sami izolirali iz okuženih bakterijskih kultur. Čistost bakteriofagne DNA in prisotnost bakterijske DNA sta močno vplivali na titer sestavljenih bakteriofagov, zato je bila to pomembna stopnja v kontroli. Stopnjo kontaminacije DNA so kvantificirali s pomočjo Nanopore, tehnologije določanja nukleotidnega zaporedja tretje generacije. Prednosti te metode so cenovna dostopnost, majhnost in prenosljivost naprave. Za obdelavo prebranih zaporedij so razvili lastno programsko opremo Sequ-Into, ki omogoča enostavno kvantifikacijo kontaminacije DNA na podlagi poravnave branj z referenčnimi zaporedji. Nanopore in Sequ-Into sta omogočila optimizacijo protokolov izolacije in čiščenja DNA, kar je izboljšalo sestavljanje bakteriofagov. Tehnologija Phactory je tako postala še bolj dostopna, saj za uporabo Sequ-Into ni potrebno globoko znanje bioinformatike.
Enkapsulacija bakteriofagov
Zadnja stopnja v Phactory je mikroenkapsulacija terapevtskih bakteriofagov v monodisperzne mikrokapsule kalcijevega alginata. To omogoči doziranje terapevtskih bakteriofagov z zaužitjem, saj so bakteriofagi v alginatu zavarovani pred proteazami in želodčnim sokom. Vpliv alginata na aktivnost in sproščanje bakteriofagov so preverjali s simuliranim črevesnim sokom in simulirano črevesno tekočino. Po izpostavitvi slednji so se sprostili funkcionalni bakteriofagi, ki so bili sposobni ponovno okužiti bakterijske celice. Rezultati nakazujejo, da je enkapsulacija bakteriofagov v alginatne kapsule primerna za oralno aplikacijo. Dodatni eksperimenti bi to ugotovitev lahko preverili še na živalskih modelih.
Zaključek
Pri projektu Phactory so dokazali možnost hitre in stabilne proizvodnje terapevtsko relevantnega titra bakteriofagov v optimiziranem celičnem ekstraktu. Pokazali so možnost shranjevanja ekstrakta z liofilizacijo in znižanja vsebnosti endotoksinov v produkta na samo 2 odstotka, brez dodatnega čiščenja. Enkapsulirani v kalcijev alginat bi bili bakteriofagi primerni za terapevtsko doziranje z zaužitjem. Sama tehnologija je preprosta, varna, cenovno zelo ugodna in omogoča hitro pripravo terapevtskega odmerka bakteriofagov kar na licu mesta - v bolnišnici.
<references/>
