Plazmidni replikoni v farmacevtski industriji

Uvod

Biološka zdravila

Z željo po zdravljenju kroničnih bolezni postajajo biološka zdravila ključen del farmacevtske industrije. Pojem »biološka zdravila« obsega tiste molekule, ki so pridobljene s sintezo ali modifikacijo in sledečo ekstrakcijo iz ekspresijskega sistema, med katere spadajo tudi proteini (encimi, katalitična protitelesa, rastni faktorji…), vitamini in nukleinske kisline (DNA in RNA cepiva, protismerne DNA, ribocimi…). Prednosti biofarmacevtikov pred sintetičnimi zdravili:
-enostavna identifikacija in validacija zdravila,
-večji razpon modifikacij biomolekule,
-cenejše in hitrejše razvojno,
-redek pojav toksičnih metabolitov v telesu pri razgradnji biofarmacevtika…
Problemi se pojavijo pri pridobivanju bioloških zdravil:
- zapletena gojišča za najbolj optimalne pogoje ogromnih količin celic,
-v primerjavi z organsko sintezo v laboratoriju je nizek izkoristek,
-občutljivost bioloških makromolekul,
-drage izolacijske metode in problemi s kontaminacijo[1]…

Uporaba L. lactis v farmacevtski industriji

Z namenom cenejšega in učinkovitejšega procesa sinteze plazmidov in proteinov so se znanstveniki posvetili mlečnokislinskim bakterijam (LAB), ki so Gram+ kemoorganotrofi koki ali bacili. Pri fermentaciji sladkorjev kot stranski produkt sintetizirajo mlečno kislino. Eden izmed najbolj raziskanih predstavnikov LAB je Lactococcus lactis zaradi intenzivne uporabe v farmacevtski, kozmetični, prehrambeni in energetski industriji. Je učinkovit proizvajalec etanola, vitamina B2, mlečne kisline, hialuronske kisline, L-alanina, vitamina B11…
V farmaciji se lahko uporabi kot proizvajalec bioloških zdravil (npr. rekombinantni proteini) in njihov transporter (npr. kot živi vektor v primeru cepiv). V primerjavi z Escherichia coli ima L. lactis boljši sekrecijski sistem, saj ima le eno proteazo (HtrA) za sekretorne proteine in sprošča v okolico le en večji protein (Usp45). Za industrijske namene to poenostavi izolacijo rekombiniranih proteinov od transformiranih celic in se izogne dragih kromatografskih metod. L. lactis je bolj varen za uporabo kot pa E. coli, saj ne sintetizira močnih imunogenih lipopolisaharidov, ki povzročajo lokalne vnetne procese.
V L. lactis je najlažje uvesti zapis za biološko zdravilo v obliki plazmida, ki s svojo sestavo tudi določa njegovo hitrost replikacije, kar vpliva na končno količino zdravilne učinkovine. V ta namen bomo predstavili, kako vrsta ori mesta vpliva na število kopij plazmida (PCN) v celici[2].

DNA-cepiva

Napredek na področju molekularne biologije je spodbudil razvoj DNA in na genih-temelječih cepiv. Ta sprožijo tako celični kot humoralni imunski odziv brez varnostnih pomislekov živih oslabljenih cepiv. DNA-cepiva sestojijo iz pDNA (plazmidna DNA) vektorja, ki omogoča vnos genov v jedro tarčnih celic, s tem pa produkcijo željenega proteina (antigena) in situ. DNA-cepiva odlikuje podaljšana ekspresija antigenov in ekspresija antigenov v njihovi naravni obliki, kar vodi v izboljšan imunski odziv.
Negativna plat DNA-cepiv je nizka imunogenost (sposobnost določene snovi, npr. antigena, da v človeškem ali živalskem telesu izzove imunski sistem) ko je to uporabljeno samo, zato so za učinkovito indukcijo imunskega sistema potrebne večje količine DNA-cepiva (1-100 𝞵g). Obstajajo tudi potencialna tveganja za onkogeno aktivacijo.
Za dostavo pDNA se med drugim uporabljajo biološki sistemi, ki vključujejo virusne in bakterijske. Virusni sistemi so najbolj učinkoviti, ampak so z njimi povezani tveganja glede varnosti. Prednost bakterijskih sistemov je doprinos k imunskem odzivu gostitelja z lastnimi imunogenskimi lastnostmi (najprimernejše so bakterije LAB in GRAS: angl. generally recognised as safe). Iz komercialnega vidika bi DNA-cepiva morala biti cenovno ugodna in preprosta za produkcijo in čiščenje.

Cepljenje z golo DNA in L. lactis kot proizvajalka pDNA

V manjšem obsegu se L. lactis uporablja za produkcijo gole pDNA, osnove DNA-cepiv. Bakterijske celice se transformira s plazmidnim vektorjem, ki ga sestavljata prokariontska replikatorna kaseta in evkariontska ekspresijska kaseta. Slednja nosi gen za željen antigen pod kontrolo evkariontskega promotorja. Po čiščenju pDNA, ki so ga proizvedle celice L. lactis, se DNA-cepivo vnese v gostiteljske evkariontske celice z ustrezno metodo (npr. elektroporacijo). pDNA se v gostiteljski celici prevede, nastali antigen pa se prestavi v citoplazmo, na površino celice ali pa se izloči. Če je v citoplazmi APC-ja (angl. antigen presenting cells kot npr. dendritska celica) pride do celičnega imunskega odziva (proliferacija CD4+ in CD8+ limfocitov T). Če je prišlo do izločanja (sekrecije), antigene lahko privzamejo APC in - kot je zgoraj navedeno - poteče celični imunski odziv. Alternativno pride do humoralnega imunskega odziva - antigen se veže na receptorje limfocitov B, ki začnejo proizvajati protitelesa. Ob izpostavitvi na celično površino vedno pride do humoralnega imunskega odziva.

Živo sluznično cepljenje in L. lactis kot nosilka DNA-cepiva ali kot proizvajalka antigenov

Živo sluznično cepljenje je strategija cepljenja, kjer se bakterijske celice, ki nosijo pDNA z zapisom za željeni antigen vnese preko sluznice gostitelja. L. lactis lahko služi kot nosilka pDNA do gostiteljskih celic sluznice, kjer se bo antigen, ki ga pDNA kodira, izrazil, ali kot in situ proizvajalka, ki prenese antigene v gostiteljsko sluznico. Ker predhodno uporabljeni bakterijski sevi za sluznično cepljenje niso popolnoma varni za človeka, so se v raziskavah pretežno usmerili v LAB. Bolj specifično, L. lactis, ki je zaradi svojih dobro proučevanih lastnostih idealni živi vektor za sluznično cepljenje.

L. lactis kot nosilka DNA-cepiva

Gola DNA je nagnjena k degradaciji v neugodnem sluzničnem okolju, uporaba bakterij za prenos pDNA predstavlja dodatno raven zaščite. Plazmidi lahko vstopijo v gostiteljsko celico s fagocitozo šele po bakterijski adheziji, katera je pogojena z ogljikovimi hidrati in proteinskim faktorji na površini bakterijske celične stene. Ta pDNA, ima kot tista v cepivu z golo DNA, evkariontsko ekspresijsko kaseto. Po prenosu v jedro, transkripciji in translaciji v antigen, se ta premakne na že prej navede lokacije za nadaljnji imunski odziv – citoplazma, celična površina in izven celice (sekrecija).

L. lactis kot proizvajalka antigenov

Živo sluznično cepljenje, kjer L. lactis zagotovi antigene v primerjavi s prejšnjima dvema metodama zahteva prokariontski ekspresijski sistem. Mesta izpostavitve antigenov so podobna kot prej: citoplazemsko - zahteva bakterijsko lizo za izločitev antigena in njegov vstop v tarčno celico, sekrecijsko – neposreden kontakt s tarčnimi celicami preko sluzničnega epitelija in ekspresijsko na celični površini - z ugnezditvijo v celično membrano je zaščiten pred proteolitično razgradnjo. Celični in humoralni odziv sta v nadaljnjih korakih glede na mesto izpostavitve enaka kot sta opisana v cepljenju z golo DNA.

Konstrukcija plazmidnih vektorjev

Konstrukcija samih plazmidov je ključnega pomena za delovanje DNA-cepiv. Že obstoječa cepiva vsebujejo plazmidne vektorje, ki največkrat vsebujejo ori regije oz. replikone plazmidov pWV01, pSH71 in pAMβ1.

Cilj konstrukcije ustreznega vektorja je proizvodnja čim večjega števila plazmidne DNA in/ali rekombinantnega proteina (antigena) z namenom uporabe v farmacevtski in drugi industriji. Izbira vektorja z ustreznim ori tipom je pomembna, saj ta vpliva na PCN (“plasmid copy number”, tj. število plazmidov na celico) in posredno na produkcijo rekombinantnega proteina. Vektorji ori tipa pWV01 imajo nizek PCN (okrog 10), vendar imajo širok nabor gostiteljskih bakterijskih celic, saj se lahko podvajajo tako v Gram pozitivnih in Gram negativnih bakterijah. Vektorji ori tipa pSH71 so zelo podobni vektorjem ori tipa pWV01, vendar imajo višji PCN (200). Podvajajo se lahko tako v Gram negativnih kot Gram pozitivnih bakterijah, s tem da so v slednjih segregacijsko veliko bolj stabilni. Vektorji ori tipa pAMβ1 so strukturno najbolj stabilni, kar omogoča vstavljanje zapisov za velike fragmente. Za razliko od prejšnjih dveh tipov, se ti vektorji lahko podvajajo zgolj v Gram pozitivnih bakterijah. Ti vektorji imajo nizek PCN, razen če so kombinirani z derivatom pAMβ1 (pIL253).

Za doseganje želenih rezultatov so derivati enega izmed treh ori tipov pogosto dodatno modificirani. Deletirajo se lahko celotni geni, zamenjajo se lahko celotni promotorji. S tem se po navadi doseže večji PCN, saj mnogi geni na plazmidu zavirajo podvojevanje plazmida. Manipulira se lahko tudi sam način izražanja antigena v celici – sekretorno izražanje antigena so znanstveniki uspešno dosegli s fuzijo zapisa za antigen in zapisa za peptid Usp45 iz L. lactis na plazmidu. Pogosto so geni, ki v plazmidu kodirajo antigen, modificirani s fuzijo z drugim zapisom za protein (najpogosteje bakterijskega izvora), ki omogoča koordinacijo antigena na membrano tarčne celice. Nekatere raziskave so tudi pokazale, da je učinek cepiva boljši, če se antigeni izrazijo že v bakterijski celici, saj so s tem bolj zaščiteni pred razgradnjo in lahko v organizmu ostanejo več dni, to pa je povezano tudi z boljšo imunizacijo.

V farmacevtski industriji ter za potrebe živilske industrije in za pridobivanje različnih metabolitov so se v preteklosti najbolj uporabljali plazmidni vektorji ori tipa pSH71 zaradi visokega PCN. Uspešnost DNA cepiv, ki targetirajo sluznice, je namreč odvisna od produkcije protiteles, bodisi v citoplazmi gostiteljske celice, bodisi na njeni membrani ali v ekstracelulariju. Izkazalo pa se je, da visok PCN lahko predstavlja velik stres za gostiteljsko bakterijsko celico, saj proces podvojevanja zahteva energijo. To moti metabolizem gostiteljske bakterijske celice in je lahko usodno za njeno preživetje. Prav tako je energijsko zahteven proces izražanja membranskih proteinov, še posebej evkariontskih, znotraj gostiteljske bakterijske celice. Ta proces sicer optimizira sam vstop plazmidne DNA oz. antigenov v celice sluznic. Najučinkovitejša DNA-cepiva omogočajo izražanje antigena na membrani tarčne celice. Da bi našli vektor, ki bi bil hkrati učinkovit in ne bi predstavljal velikega stresa za gostiteljsko bakterijsko celico, so potrebne nadaljnje raziskave.

Viri

[1]Dasani, Serena, et al. “Chapter 85 - Biopharmaceuticals.” Translational Surgery, edited by Adam E. M. Eltorai et al., Academic Press, 2023, pp. 535–38. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/B978-0-323-90300-4.00056-2.
[2]Morello, E., et al. “Lactococcus Lactis, an Efficient Cell Factory for Recombinant Protein Production and Secretion.” Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, vol. 14, no. 1–3, 2008, pp. 48–58. PubMed, https://doi.org/10.1159/000106082.
[3]Duarte, S.O.D.; Monteiro, G.A. Plasmid Replicons for the Production of Pharmaceutical-Grade pDNA, Proteins and Antigens by Lactococcus lactis Cell Factories. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1379. https://doi.org/10.3390/ijms22031379