Pobeg iz X-inaktivacije

Zaradi uravnavanja količine izraženih genov, povezanih s spolnimi kromosomi, pri moških (XY) in ženskah (XX), je večina genov na enem izmed kromosomov X pri ženskah utišanih z inaktivacijo. Na kromosomu X pa se nahajajo tudi geni, ki pobegnejo X-inaktivaciji, izražajo se tako iz aktivnega (Xa) kot utišanega kromosoma (Xi).

Da morajo nekateri geni pobegniti inaktivaciji so najprej predvidevali na primeru psevdoavtosomnih genov. Le v primeru, da se tudi iz utišanega kromosoma X izražajo psevdoavtosomni geni, je lahko število izraženih genov pri obeh spolih enako. Prav tako inaktivaciji pogosto pobegnejo geni, ki se ne nahajajo na psevdoavtosomnih regijah, imajo pa svoj homolog na kromosomu Y. Zanimivo pa je, da pred inaktivacijo pobegnejo tudi geni, ki so svoj homolog na kromosomu Y izgubili.

Značilnosti genov, ki pobegnejo inaktivaciji

Izražanje alela na inaktiviranem X-kromosomu ni enako tistemu na popolnoma aktiviranem X-kromosomu. Za pobegli gen velja gen, ki se izraža iz utišanega kromosoma X in njegova aktivnost dosega vsaj 10% aktivnosti alela na kromosomu Xa. S sistematično preiskavo človeškega kromosoma X so ugotovili, da kar 15% vseh genov na utišanem kromosomu pobegne inaktivaciji.

Pobegli geni so po kromosomu razporejeni neenakomerno, razporeditev pa ni naključna. Večina pobeglih genov pri ljudeh se nahaja na krajšem kraku kromosoma (Xp). To povezujejo z evolucijo, saj se je ta regija najkasneje spremenila, prav tako pa je ta regija bolj oddaljena od lokacije gena XIST, ki je odgovoren za inaktivacijo.

Povezavo med pobeglimi geni in evolucijskim razvojem spolnih kromosomov so ugotovili s primerjanjem izražanja genov pri različnih vrstah. Ugotovili so, da “mladi” geni pogosteje pobegnejo inaktivaciji. S postopnim zmanjševanjem kromosoma Y pa se uravnava tudi inaktivacija kromosoma X. “Stari” geni, ki nimajo več ustreznega homologa na kromosou Y počasi izgubijo možnost pobega pred inaktivacijo.

Pri ljudeh se pobegli geni nahajajo na skupnih domenah, do 13 genov skupaj. Tudi uravnavanje inaktivacije poteka na nivoju domen kromosoma. Inaktivaciji zaradi tega pobegnejo geni, ki ležijo znotraj domene, ki vsebuje vsaj en gen, ki ima svoj homolog na kromosomu Y. Ali se bo nek gen utišal ali ne je torej močno odvisno od tega, kje na kromosomu se ta gen nahaja.

Variabilna inaktivacija

Večina pobeglih genov je stalno aktivna, obstajajo pa tudi geni, ki inaktivaciji ne pobegnejo vedno. Pri človeku je takih genov približno 10%. Stopnja aktivnosti alela iz Xi se razlikuje med posameznicami, med različnimi tkivi in tudi med samimi celicami v tkivu. Primer takega gena je REP1, ki se v nekaterih celičnih linijah izraža zgolj iz Xa, v drugih pa se izraža bialelno.

Izražanje genov iz Xi pa se spreminja tudi skozi razvoj posameznice. Tak pojav lahko spremljamo pri mišjem genu Kdm5C. V odrasli živali gen vedno pobegne inaktivaciji, utišan pa je v večini embrionalnih celic.

Zaradi tega prihaja do razlik med ženskami, do razlik med spoloma in do bolezni, ki so povezane z nenavadnimi kombinacijami spolnih kromosomov.

Faktorji, ki vplivajo na izražanje genov na Xi

Mehanizme pobega iz X-inaktivacije so odkrivali na podlagi razlik, ki so jih našli med utišanimi in pobeglimi geni. Izkazalo se je, da imajo največjo vlogo epigenetski označevalci in razporeditev ponavljajočih se zaporedij na DNA.

Epigenetski označevalci, ki vsekakor pomenijo utišanje nekega gena, so pri inaktiviranem X-kromosomu:

• trimetilacija lizina 27 na histonu H3, kar katalizira kompleks PRC2;
• trimetilacija lizina 9 na histonu H3;
• vključitev drugačne različice histona H2A – macroH2A.

Teh pri pobeglih genih ni, najdemo pa t.i. aktivne označevalce, ki so:

• acetilacija na histonih H3 in H4;
• trimetilacija lizina 4 na histonu H3.

Prisotnost enih ali drugih je izključujoča – inaktivne označevalce najdemo samo pri utišanih genih, aktivne pa samo pri pobeglih.

Ponovitve na DNA, ki igrajo ključno vlogo pri inaktivaciji ali pobegu, so LINE-1 (angl. long interspersed nuclear elements, dolgi razpršeni jedrni elementi), LTR (angl. long terminal repeats, dolge končne ponovitve) in motivi, bogati z A in T. Nobene izmed navedenih ponovitev ne najdemo pri pobeglih genih, kar nakazuje, da razporeditev in vsebina motivov na DNA inaktiviranega X-kromosoma vpliva na utišanje ali pobeg preko kontrole z Xist RNA in/ali vezavo specifičnih proteinov. Zraven Xist so v to kontrolo vključene tudi druge lncRNA.

Soobstajanje utišanih in pobeglih regij na Xi

Inaktivirani in pobegli geni se na X-kromosomu nahajajo zelo blizu skupaj, zato morajo med njimi obstajati ločnice. Odkrili so nekaj mejnih elementov, za katere se predvideva, da opravljajo to funkcijo, pomembna pa je tudi prostorska orientacija kromatina.

Med mejne elemente spadajo t.i. kromatin izolatorski proteini, ki preprečujejo širjenje heterokromatina v pobegle regije oz. obratno, preprečujejo širjenje evkromatina v utišane regije. Mednje spada protein CTCF.

CTCF se pri miših veže na prehodno regijo med pobeglim genom Kdm5c in inaktiviranim Iqsec2, pri ljudeh pa ne, zato pri ljudeh oba gena uideta inaktivaciji. To ni edini primer vezave CTCF-ja na prehodne regije med geni, prav tako pa omogoči, da ostanejo pri miših CpG otočki na 5' koncu Kdm5c hipometilirani, s čimer se izognejo inaktivaciji. Obstajajo tudi dokazi, da vezava samo CTCF ni zadostna zaščita pred utišanjem: če vstavimo CTCF-jeva vezavna mesta na oba konca nekega kratkega represorskega gena in to vstavimo v inaktiviran gen na mišjem Xi, to samo po sebi še ne prepreči utišanja.

Pri soobstoju utišanih in pobeglih regij na Xi je pomembna tudi prostorska orientacija kromatina. Vemo, da LINE-1 ponovitve, ki jih najdemo v utišanih genih, močno pripomorejo h kondenzaciji kromatina – heterokromatin se močno zgosti, okrog se ovijejo zaporedja, inaktivirana z Xist, pobegli geni pa tako pristanejo na najbolj zunanji plasti, kjer se izvihajo v obliki zank. V tem primeru bi lahko kot funkcijo CTCF-ja razumeli to, da ščiti utišane domene pred izvihanjem in s tem reaktivacijo.  

Pobegli geni in razlike med spoloma

Klasična dogma spolne diferenciacije pri sesalcih je bila postavljena v dvajsetem stoletju in pravi, da se določen z Y-kromosomom povezan gen, imenovan Sry (angl. Sex-determining region Y) začne izražati v še nediferenciranih spolnih žlezah in povzroči pretvorbo tega tkiva v testise. Ti nato že prenatalno izločajo hormon testosteron in Müllerijski zaviralni hormon (angl. Müllerian-inhibiting hormone), ki spodbujata moško in zavirata žensko diferenciacijo ostalih tkiv. Spolni hormoni so bili zelo dolgo sprejeti kot edini povzročitelj razlik med spoloma, v zadnjih letih pa je bila opisana dogma označena za nepopolno, saj ne pojasnjuje številnih razlik do katerih prav tako prihaja med spoloma in ki jih povzročajo tudi drugi spolno-specifični signali, kot so na primer razlike v komplementu spolnih kromosomov.

Ugotavljanje vpliva spolnih kromosomov in izražanja genov na spolni dimorfizem je težko predvsem zaradi potencialnega vmešavanja spolnih hormonov. Za preučevanje je bil uporabljen model miši štirih različnih genotipov, pri katerem komplement spolnih kromosomov ni odvisen od spola miši. Genetska modifikacija poteka v dveh korakih, najprej pride do izbrisa Sry gena z Y-kromosoma, nato pa je transgen Sry, ki ima lasten endogeni promotor, vstavljen v enega izmed avtosomov. V tem postopku je bil torej gen, ki določa razvoj testisov, prenešen z Y-kromosoma, tako da ta ne določa več spola. S parjenjem XX ženske in XY-Sry moškega se razvijejo potomci s štirimi različnimi genotipi, in sicer XX ženske, XY- ženske, XXSry moški in XY-Sry moški.

Omenjeni model je bil uporabljen pri preučevanju vpliva spolnega kromosomskega komplementa in dejanskega spola osebkov na izražanje določenega pobeglega gena. Mišji Jarid1c in človeški JARID1C sta gena, ki pobegneta X inaktivaciji in sta tako pri ženskah izražena z obeh alelov. Zapisujeta za encim histonsko demetilazo, ki katalizira odstranitev metilnih skupin s tri-metiliranega lizina 4 na histonu H3. Rezultat tega je represija gena zaradi odstranitve aktivne epigenetske oznake. Ob delovanju omenjenega gena je zavrto predvsem prepisovanje specifičnih genov v nevronih, kar kaže na to, da je pri človeku JARID1C vpleten v diferenciacijo nevronov. Predmet raziskave je bil mišji gen, izsledke pa so posplošili tudi na človeškega.

Ugotovljeno je bilo, da je stopnja izražanja Jarid1c v možganih odraslih miši odvisna le od kromosomskega komplementa ter neodvisna od fenotipskega spola osebka. XX miši so izražale gen v večji meri kot XY miši, kar se sklada s pobegom gena iz X inaktivacije in posledično prisotnostjo dveh aktivnih kopij gena pri osebkih z dvema X-kromosomoma.

Obstaja tudi Y-paralog, Jarid1d, ki je prav tako histonska demetilaza in naj bi imel podobno funkcijo. Izražanje Y-paraloga pri moških bi lahko teoretično kompenziralo povečano izražanje X-paraloga, vendar izsledki raziskav kažejo, da do tega ne pride. Razlog za to je morda njegovo nahajanje na v veliki meri heterokromatinskem Y-kromosomu.

Razlike v izražanju Jarid1c v možganih med moškimi in ženskimi osebki naj bi vodilo do razlik med spoloma in sicer domnevajo, da naj bi pri moških izzvale agresivnejše vedenje – za postavitev kakšnih trdnejših hipotez pa bodo potrebne nadaljnje raziskave.

Mutirani geni in njihovo izražanje v osebkih različnega spola

Vpliv mutacij na X-kromosomu na fenotip je v veliki meri odvisen od spola osebka ter pri ženskah od načina regulacije izražanja določenega X-kromosoma. Moške prizadenejo tako recesivne kot dominantne mutacije, saj imajo le po en alel. Pri ženskah pa je fenotipski učinek odvisen tudi od tega ali je mutiran gen podvržen X-inaktivaciji ali ji pobegne. V prvem primeru je lahko manifestacija mutacij genov, povezanih z X-kromosomom, utišana z naključno inaktivacijo, kar vodi do mozaicizma, lahko pa je tudi povsem izničena s strani preferenčne inaktivacije X-kromosoma, ki nosi mutiran gen (angl. X chromosome inactivation skewing). Preferenčna inaktivacija X-kromosoma, na katerem je mutiran gen, je dokaj pogost pojav v ženskih osebkih, običajno se pojavi v tistih tipih celic, v katerih je izražanje normalnega alela ključno.

V primerih, ko pa mutiran gen pobegne X-inaktivaciji, je njegov vpliv odvisen od stopnje izražanja z inaktiviranega X-kromosoma. Prej omenjena selektivna inaktivacija X-kromosoma z mutiranim genom lahko tako le delno obnovi normalen fenotip, saj se gen zaradi pobega do neke mere vedno prepisuje.

Mutacije v genih, ki se izražajo le v moških organih, na primer testisih, prizadenejo le moške. Ker pa je večina takih genov amplikonskih, kar pomeni, da na določenem območju kromosoma obstaja več kopij gena, bo učinek mutacije, ki se nahaja le v eni kopiji, razmeroma majhen na račun številnih normalnih kopij.

Mutacije, delecije in podvojitve posameznih pobeglih genov povzročijo številne nenormalne fenotipe, med drugim tudi raka. Pri tem imajo pomembno vlogo preoblikovalci kromatina, saj lahko globalno vplivajo na izražanje genov preko dodajanja in brisanja epigenetskih oznak. Kot primer vzemimo mutacije v pobeglem genu KDM6A, ki zapisuje za specifično demetilazo (angl. Lysine-specific demethylase 6A). Njihova posledica je maligen možganski tumor, rak prostate oziroma rak na ledvicah.  

Viri

• Arnold, A.P. Mouse Models for Evaluating Sex Chromosome Effects that Cause Sex Differences in Non-Gonadal Tissues. Journal of Neuroendocrinology, 2009, letn. 21, str. 377-386.
• Berletch, J.B., Yang, F., Xu, J., Carrel, L. in Disteche, C.M. Genes that escape from X inactivation. Human genetics, 2011, letn. 130, št. 2, str. 237-245.
• Carrel, L., Willard, H.F. X-inactivation profile reveals extensive variability in X-linked gene expression in females. Nature, 2005, letn. 434, str. 400-404.
• Deng, X., Berletch, J.B., Nguyen, D.K., Disteche, C.M. X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease. Nature, 2014, letn. 15, str. 367-378.
• Peeters, S.B., Cotton, A.M., Brown, C.J. (2014). Variable escape from X-chromosome inactivation: Identifying factors that tip the scales towards expression. BioEssays, letn. 36, št. 8, str. 746-756.
• Xu, J., Deng, X., Disteche, C.M. Sex-Specific Expression of the X-Linked Histone Demethylase Gene Jarid1c in Brain. PLoS ONE, 2008, letn. 3, št. 7.