Posebnosti in primeri RNAi pri rastlinah

V zadnjih nekaj letih je bil dosežen pomemben napredek tudi na področju utišanja genov v rastlinah. RNA interferenca (RNAi) je ena izmed najzanimivejših odkritij in zelo koristno orodje na področju funkcijske genomike. Je pojav, ki preko utišanja določenih genov uravnava ekspresijo le-teh. Post-transkripcijsko utišanje genov (PTGS) je bilo sprva omejeno le na rastline. V zadnjih nekaj letih pa je postalo jasno, da se PTGS pojavlja tako pri rastlinah kot tudi živalih in ima pomembno vlogo pri obrambnem mehanizmu pred virusi ter transpozonskem utiševalnem mehanizmu.

Prvi poskusi RNAi na rastlinah

Raziskovanje RNA-interference pri rastlinah se je pričelo z okrasnimi rastlinami t.i. petunjami. Le-te so znanstveniki v ZDA želeli narediti bolj temno vijolične barve. V ta namen so v petunije vpeljali dodatne kopije endogenega gena CHS, ki kodira ključni encim za proizvodnjo pigmenta antocianina. Rezultati, ki so jih dobili so bili presenetljivi. Izkazalo se je, da kljub temu, da je veliko petunij vsebovalo dodatne kopije gena, produkcija antocianina ni bila povečana, ampak inhibirana. Namesto povečanja intezitete temno vijolične barve, so rože postale popolnoma bele oz. belo-vijolične. Podrobnejša raziskava je pokazala,da je prišlo do zmanjšanja izražanja endogena in transgena oziroma, da sta bila oba tipa gena utišana. Pri tem je očitno prišlo do visoke stopnje razgradnje mRNA, ki je onemogočila prepis proteina. Ta pojav so poimenovali kosupresija, vendar takrat molekulskega mehanizma še niso razumeli.

Razlike med RNAi pri živalih in rastlinah

Kljub podobnosti v procesih RNAi pri omenjenih organizmih, obstajajo tudi očitne razlike. Vloga miRNA v rastlinah je enaka vlogi siRNA pri živalih, kar pomeni, da je prisotna pri cepitvi homologne mRNA hkrati pa lahko blokira translacijo le-te. Razlika pa je tudi v vezavi miRNA na njeno specifično zaporedje na mRNA. V rastlinah je miRNA v večini primerov popolnoma komplementarna sekvenci na mRNA in povzroči direktno cepitev ob prisotnosti RISC, medtem ko je pri živalih miRNA bolj divergenta, ni popolnoma komplementarna svoji tarčni mRNA in vpliva na represijo translacije. Pri rastlinah prav tako nastopata dva posebna gena, ki ju pri živalih niso odkrili. Imenujeta se MET1 (gen, ki kodira DNA-metiltransferazo) ter SGS3 (kodira protein, katerega funkcija zaenkrat še ni znana). Gena v živalski celici nista prisotna, kar pomeni, da za RNAi v živalih nista pomembna. Živali ponavadi vsebujejo en tip proteinov dicer, pri čemer pa se pri rastlinah pojavlja večje število le-teh. Raziskovali so zeliščno rastlino Arabidopsis ter našli 4 različne encime dicer. Pri Arabidopsis so dicerji 2, 3 in 4 pomembni za nastanek različnih siRNA vrst, medtem ko je dicer 1 odgovoren izključno za miRNA biogenezo. Aktivacijo vsakega dicerja omogoča siRNA karakteristične dolžine. Razen drugih protein v miRNA poti, pri rastlinah poteka enaka miRNA biogeneza kot pri živalih. Edina večja razlika je opažena pri rastlinah in sicer DCL1 deluje na pre-miRs v jedru in ne v citoplazmi, kot se to dogaja pri živalih.

Tehnologija RNA interference

Tehnologijo RNA interference lahko koristno uporabimo pri velikem številu rastlinskih vrst. Rastlinam lahko utišamo ekspresijo specifičnih endogenih genov ali genov patogenov, ki jih napadajo. RNAi lahko uporabljamo tudi za inženiring metabolnih poti za ustvarjanje sekundarnih produktov. Dosežemo lahko visok pridelek in pridobitev izboljšanih rastlin, ki so boljše za zdravje človeka. Eden izmed načinov kako pridobiti dvojnovijačno RNA (dsRNA) je kloniranje »smiselnih« in »nesmiselnih« sekvenc pod istim promotorjem, ki jih ločimo z introni. Po transkripciji te sekvence tvorijo RNA zanko, ki sproži utišanje genov. Prav tako se za utišanje genov uporablja rastlinski patogeni virus (VIGS). Proces se imenuje z virusi inducirano utišanje genov. To utišanje je za razliko od prejšnjega načina začasno. Utišanje promotroskih sekvenc z uporabo te metode je dedno, saj metilirane promotorske sekvence ostanejo metilirane v nekaj naslednjih generacijah. Rastline so pomembni naravni vir hrane, vlaken, lesa, olj itd. Veliko pomembnih sekundarnih metabolitov rastline proizvajajo v majhnih količinah in jih je zato težko pridobiti v zadostnih količinah. Proizvodnjo sekundarnih metabolitov rastline lahko povečamo z uporabo RNAi (npr. pridobivanje stearinske in oleinske kisline pri bombažu). Efekt utišanja genov pri rastlinah so najprej uporabili v poskusih razvoja odpornosti na bolezni, predvsem tistih, ki jih povzročajo virusi. Odpornost na patogene so dosegli s transformiranjem rastlin z geni ali s sekvencami, ki so jih dobili iz patogenov, z namenom blokiranja specifičnega koraka v življenju ali ciklu infekcije patogena. Ko utišanje enkrat dosežemo, se to razširi po celem organizmu, zato je odpornost pogosteje sistematska kot lokalna. Razširitev signala utišanja preko celotne rastline ima določene prednosti, ob tem pa tudi nekaj škodljivih posledic. Sistemsko širjenje signala utišanja, ki ga uvedemo z dsRNA je zelo uporabno v hortikulturi (npr. pri vinski trti in sadnemu drevju), kjer transgene rastline vzgojimo zelo težko. Učinkovitost RNAi tehnologije za proizvodnjo na viruse odpornih rastlin je bilo prvič dokazano leta 1998 pri krompirju, ki je bil odporen na Krompirjev virus Y. Pri nekaterih virusih so dosegli imunost rastline, pri drugih okrevanje po okužbi, zmanjšano kopičenje virusov v rastlini, blokiranje virusne infektivnosti, medtem ko so drugi virusi utišanje premagali. Pri nekaterih virusih stopnja odpornosti variira med tkivi. Nekateri rastlinski virusi so razvili načine proti utišanju genov s kodiranjem proteinov, ki lahko premagajo odpornost. RNAi so uporabili tudi za generiranje moške sterilnosti in za obnavljanje moške plodnosti. Slednje je pomembno za produkcijo hibridnih semen pri rastlinah, kot so oljna repica, koruza in sončnice, kjer je rastlina zrasla iz semen druge generacije hibridnih rastlin.

Primeri RNAi pri rastlinah

S tehnologijo RNA interference bi v prihodnosti lahko tudi omejili škodo, ki jo povzročajo insekti na rastlinah. Dokler niso naredili novih raziskav na področju RNAi je bilo najbolj učinkovito v boju proti insektom, narediti rastline, ki so sintetizirale protein Bt toksin. Bt toksin insekte upočasni, zaradi njega prenehajo jesti rastline in nato poginejo. Po novih raziskavah pa so ugotovili, da Bt toksin ni učinkovit proti mnogim škodljivcem ker je veliko takih, ki so nanj sposobni razviti odpornost. Veliko vrst insektov je herbivorov ki so, v procesu evolucije, prilagodili svoj metabolizem tako da strupi, ki jih rastline izločajo da bi se znebile insektov, nimajo učinka. Ker so vse informacije, ki insektom omogočajo obrambo proti strupom, shranjene v njihovem genskem zapisu, bi veliko pomenilo če bi te gene poznali in jih znali utišati z RNAi. Pri RNAi problemov z odpornostjo insektov ni, saj gensko spremenjene rastline, pri pobijanju insektov, izkoriščajo mehanizem utišanja genov, ki ga insekti že imajo in uporabljajo. Zato je RNAi šibka točka imunskega sistema insektov in drugih živali. Insekti, ki izklopijo RNA interferenco zato da se lahko varno prehranjujejo z gensko spremenjenimi rastlinami, bodo najverjetneje poginili zaradi bolezni. Druga slabost Bt toksina pa je njegova nespecifičnost, saj lahko pobije tudi tiste insekte, ki ne predstavljajo škode za rastline. Presenetljivo je bilo odkritje, da je pri nekaterih insektih dovolj že to, da zaužijejo dvovijačno RNA. Na primer, če se ličinke hranijo z gensko spremenjenim tobakom, RNA pride v njihov prebavni trakt. Po prvih korakih interference se RISC specifično veže na mRNA in jo tako razreže, da se encim citokrom P450 ne more več sintetizirati. Ker bi genetsko spremenjene rastline, ki se poslužujejo RNAi, napadale točno določene gene v točno določenih insektih, nekateri raziskovalci menijo, da naj nebi povzročale nezaželjenih učinkov in bi bile varnejše od ostalih gensko spremenjenih rastlin. Spet drugi opozarjajo, da je potrebno narediti še veliko testov in raziskav, saj bi se v primeru nespecifičnosti RNAi, mehanizem utišanja genov lahko prenesel na druge vrste rastlin ali celo na druge organizme. Iz podobnih razlogov so gensko spremenili še bombaž, koruzo...

Zaključek

RNAi postaja vedno bolj pomembna metoda za preučevanje funkcij genov pri evkariontih, saj je metoda zelo učinkovita in s poglobljenimi raziskavami, jo bomo s pridom izkoriščali pri genetskem izboljšanju rastlin. Utišanje z RNAi je enostavna metoda, ki se uporablja za utišanje genov tudi pri heksaploidnih organizmih in enokaličnicah (kulturne rastline,iz katerih pridobivamo večino hrane), kjer so drugi pristopi neučinkoviti. Čeprav tehnika utišanja z RNAi še ni optimizirana, so jo že leta 1998 označili za perspektivno tehniko pridobivanja rastlin z 'znotraj celično odpornostjo' proti virusom.

Viri in literatura

1. Vaucheret H., Beclin C.; »Post-transcriptional gene silencing in plants«;Cell Science; September, 2001; 3083-309.

2. Saumet A.,Lecellier C.; »Anti-viral RNA silecing: do we look like plants?«; Januar 2006; [citirano: 30.3.2011] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1363733/?tool=pmcentrez

3. Raza Naqvi A.;«The fascinating world of RNA interference«; International Journal of Biological Science; 2009, 97-117.

4. Mansor S., Amin I., Hussain M., Zafar Y., Briddon R.W: 2006. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science, 11, 11: 595-565

5. U.B. Jagtab, R.G. Gurav, V.A. Bapat : 2011. Role of RNA inteference in plant improvement. Naturwissenschaften,98 : 473-492.

6. Huvenne H., Smagghe G.Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. Journal of insect physiology, 2010, 56, 227-235

7. "Yellow biotechnology": Using plants to silence insect genes in a high-throughput manner. ScienceDaily, 2012