Pretvorba proteinskih odpadkov v biogoriva in amonijak z bakterijo B. subtilis

V današnjih časih je pomembno razviti nove vire obnovljive energije ter nove tehnologije za sintezo kemikalij iz obnovljivih surovin, da bi omilili globalne klimatske spremembe (Sims, 2001; Upham 2009). Pri samem razvoju večinoma ne upoštevamo vpliva dušikovih onesnaževal, ki izhajajo iz gnojil. Danes obstajajo inženirsko spremenjeni mikrobi, ki so sposobni sinteze biogoriv. Takšni procesi potrebujejo dušikova gnojila, ki pa se ne morejo obnoviti ali reciklirati. Večina teh gnojil se nahaja v proteinskih odpadkih, kjer se razgradijo do dušikovega oksida ter ostalih okoljskih toksinov. Recikliranje dušikovih gnojil iz proteinske biomase bi lahko zmanjšalo negativni vpliv dušikovega oksida na okolje.

Proteini se lahko pretvorijo v aminokislinske ostanke z deaminacijo v centralnem metabolizmu mikrobov. Ta katabolična reakcija proizvede prosti amonijak in 2-ketonske kisline. Prosti amonijak se lahko uporabi za sintezo vseh ostalih dušikovih metabolitov. Od zmožnosti metabolnega seva pa je odvisna poraba 2-ketonskih kislin. Z metaboličnim inženirstvom lahko omogočimo izločanje amonijaka, ki ga uporabimo za gnojila, in tok 2-ketonskih kislin izrabimo za sintezo mnogih tržnih kemikalij.

Namen

Kmetijski in komunalni odpadki predstavljajo veliko onesnaženje bogato s proteini. Če z njimi ne ravnamo pravilno, se širijo skozi celoten ekosistem in povzročijo kontaminacijo vode, zakisanje zemlje, emisije toplogrednih plinov ter ostale okoljske probleme (Galloway et al., 2008; Montzka et al., 2011; Wernick in Liao, 2013). V tej raziskavi so želeli razviti sistem, ki bi bil zmožen proteinske pretvorbe. Z njim bi lahko sintetizirali biogoriva ter aminokisline. Z recikliranjem amonijaka pa bi lahko naredili kemikalije z dodano vrednostjo. Z izkoriščanjem fermentacijskih odpadkov pa bi se zmanjšali tudi stroški. Izkazalo se je, da je B. subtilis uporaben gostiteljski sev, ki je zmožen pretvarjati odpadke in tako omiliti okoljsko odlaganje.

Uvod

S pomočjo metabolnega inženirstva so spremenili bakterijo Bacillus subtilis tako, da je bila sposobna hidrolize polipeptidov s pomočjo izločenih proteaz in pretvorbe aminokislinskih ostankov v biogoriva ter gnojila z amonijakom. Za preusmeritev metabolizma pretvorbe aminokislinskih ostankov je bilo potrebno inaktivirati regulator CodY. CodY regulira biosintezo in razgradnjo razvejanih aminokislinskih ostankov BCAA (angl.: branched-chain amino acid). Deletirali so tudi gen za lipoamid aciltransferazo (bkdB) in s tem preprečili pretvorbo razvejanih 2-ketonskih kislin v derivate acil-CoA. Zaradi zgoraj naštetih modifikacij in heterolognega izražanja encimov dekarboksilaze ketokislin in alkohol dehidrogenaze je končni sev sintetiziral biogorivo ter amonijak iz medija bogatega z aminokislinskimi ostanki.

Rezultati

Uporabili so različne strategije, da bi preusmerili tok ogljika ter dušika za učinkovito pretvorbo polipeptidov iz proteinske mase. Iz že znanih ugotovitev so vedeli, da je regulacija odvisna od regulatorja CodY (Huo et al., 2011; Keseler et al., 2013). Pomemben je pri represiji izražanja številnih genov ilvABHCD, leuABCD, ybgE, ald (gen za alanin dehidrogenazo), yhdG (gen za transporter aminokislinskih ostankov), appBC (gen za oligopeptid permeazo) in dppBC (gen za dipeptid permeazo). Geni ilvABHCD in leuABCD so vključeni v biosintezo razvejanih aminokislinskih ostankov BCAA, zadnji trije geni pa so vključeni v cikle deaminacije. Geni yhdG, appBC in dppBC so pomembni pri proteoliznem procesu, ki olajšuje privzem prostih aminokislinskih ostankov, oligopeptidov ter dipeptidov, ki nastanejo z razgradnjo proteinskih odpadkov. Na podlagi teh rezultatov so deletirali gen codY in prekomerno izrazili LeuDH, da so pospešili pretok dušika. Inaktivacija regulatorja CodY je povečala sintezo razvejanih aminokislinskih ostankov preko aktivacije operona ilv-leu. Sočasna inaktivacija BkdB je preprečila biosintezo razvejanih maščobnih kislin in omogočila večjih množin višjih alkoholov in amonijaka. Titer biogoriva je znašal 1,00 ± 0,13 g/L in titer amonijaka je znašal 2,22 ± 0,09 g/L. Končno biogorivo je bilo sestavljeno iz 28 % etanola, 16 % izobutanola ter 56 % metilbutanola.

Ti rezultati kažejo, da se je metabolna regulacija predvidoma razvila v pogojih, kjer je malo hranil. Zato so morali modificirati poti, da bi bil B. subtilis zmožen tvoriti produkte v gojišču bogatem s proteini. Pretvorbo polipeptidov in celične biomase v višje alkohole ter amonijak so preučevali s končnim sevom KY11ΔcodYΔbkdB. Modelni polipeptidi, biomasa cianobakterije S. elongatus ter E. coli so služili kot proteinski substrati. Razen kazeina je izkoristek pretvorbe vsakega proteinskega substrata znašal 45-75 % vsega biogoriva in produktov amonijaka.

Zaključek

V tej raziskavi je avtorjem uspelo pripraviti organizem B. subtilis seva KY11ΔcodYΔbkdB za prečiščeno proteinsko pretvorbo za obnavljanje amonijaka in sintezo biogoriv. Končni sev je imel deletirana gena, ki zapisujeta za proteinski regulator CodY ter lipoamid aciltransferazo BkdB, in prekomerno izražene deaminazne gene leuDH , kivD ter yghD. Deaminazne gene so vstavili v plazmid pKY11 pod kontrolo močnega promotorja Pspac (IPTG inducibilni promotor). Te modifikacije so dale največje titre višjih alkoholov in amonijaka. B. subtilis izloča proteaze, zato ni potrebe po ločeni proteolizi in posledično se zmanjšajo stroški. Ta sev za svojo rast ne potrebuje aminokislin z visoko vrednostjo (Trp, Lys, Met), zato se le te lahko prodajajo kot krma za živino. Te aminokisline so na trgu vredne več milijard dolarjev (Takamatsu et al., 2011).

Članek

Choi, K.-Y., et al., Consolidated conversion of protein waste into biofuels and ammonia using Bacillus subtilis. Metab. Eng. (2014).