Priprava bispecifičnih IgG protiteles s pomočjo ustvarjanja strukturno baziranega ortogonalnega Fab vmesnika.
Človeška monoklonska protitelesa imajo visoko specifičnost do določenega antigena. So pa v nekaterih terapevtskih aplikacijah bolj uporabna bispecifična protitelesa. To so protitelesa, ki lahko vežejo dva različna antigena. Eden izmed možnih načinov uporabe takih protiteles je, da delujejo kot povezovalni most med površinskima proteinoma na tumorski celici in celici T ubijalki. Je pa priprava bispecifičnih protiteles zahtevna tudi, če že imamo na voljo monoklonski protitelesi z želeno specifičnostjo.
Pred kratkim pa sta bili objavljeni metodi, ki precej olajšata izražanje bispecifičnih protiteles. Pri prvi (Spiess in sod.) gre za ločeno izražanje »polovic« protiteles v periplazmi bakterij E. coli, pri drugi metodi (Lewis in sod.) pa gre za izboljšanje produkcije bispecifičnih protiteles v evkariontskih celicah. Glavna težava pri produkciji bispecifičnih protiteles je, da prihaja do povezovanja napačnih lahkih in težkih verig med sabo, če jih izražamo v isti celici. Medtem, ko so Spiess in sodelavci specifičnost povezovanja težke in lahke verige (polovice protitelesa) zagotovili z ločenim izražanjem težke in lahke verige za eno specifičnost v enem tipu E. coli in druge v drugem tipu, so Lewis in sodelavci morali v evkariontskem sistemu najti drugačen način.
Uporabili so kombinacijo računalniškega načrtovanja, tarčne mutageneze in x-žarkovne kristalografije za identifikacijo mutacij. Te mutacije so vnesli na aminokisline, kjer se povezujejo V(H)-V(L) in C(H)1-C(L) domene težke in lahke verige. Delujejo podobno metodi za specifično povezovanje težkih verig protiteles z različno specifičnostjo (dveh različnih »polovic«), ki jo je razvil Paul Carter v 90. letih. Tu gre za vnos specifičnih aminokislinskih parov v C(H)3 domene težkih verig. Ti favorizirajo povezovanje izbranih težkih verig med sabo. Lewis in sod. so za dizajniranje primernih mutacij uporabili program Rosetta, ki izračuna vezavne energije interakcij med proteini in omogoča iskanje mutacij, ki povečajo energijsko razliko med zaželenimi in nezaželenimi interakcijami med proteini, obenem pa ohranijo stabilnost dobljenih kompleksov. Tako so za C(H)1-C(L) domene pripravili več kot 40 različnih aminokislinskih zaporedij in jih testirali v laboratoriju. Da so lahko izvedli teste, so morali pripraviti konstrukte IgG protiteles z mutiranimi zaporedji brez variabilnih delov. Z SDS-PAGE so ugotovili, da se ti konstrukti pravilno sestavljajo in so stabilni (preverili z DSC). Le 10 izmed takih mutiranih konstruktov pa se je v HEK239 celicah izražalo na isti ravni kot WT konstrukti brez variabilnih delov. Konstrukti z manj mutacijami so se nasplošno izražali bolje in so jih zato uporabili za testiranje povezovanja med različnimi mutiranimi težkimi in lahkimi verigami. Tako so dobili tri pare mutiranih težkih in lahkih verig, ki so se med sabo bolj stabilno povezovali kot z WT variantami. Mutacije iz dveh izmed konstruktov, C(L)_L135F/C(H)1_V190F_F174T in C(L)_K129D/C(H)1_D146K, so združili v skupni konstrukt, ki so ga poimenovali CRD1. Rešili so tudi kristalno strukturo tega konstrukta in ugotovili, da se zelo dobro sklada s predvidenim modelom. Tretji par mutiranih težkih in lahkih verig pa so poimenovali CRD2. Preden je bil uporaben, so ga morali v njega vnesti še dodatne mutacije, da so odpravili neskladanja s predvidenim modelom. Nato so izražali mutirane težke verige z mutiranimi ali WT lahkimi verigami in obratno v vseh možnih kombinacijah. Z masno spektrometrijo so preverili, katere verige se najbolje povezujejo med sabo. Iz rezultatov analize so ugotovili, da se pari mutiranih verig, med sabo bolje povezujejo kot z ostalimi WT ali mutiranimi verigami in so tudi bolj stabilne. Ker pa pri testiranju teh parov mutiranih verig na IgG, ki je vseboval variabilne regije pertuzumaba, niso dobili pričakovanih rezultatov, so se odločili vnesti še mutacije v V(H) in V(L) domeni. Mutacije so vnesli na ohranjena mesta variabilnih domen, da bi bile uporabne v čim več protitelesih. Konstrukts V(L)_Q38D-V(H)_Q39K/V(L)_D1R-V(H)_R62E so poimenovali VRD1 in konstrukta V(L)_Q38R-V(H)_Q39Y VRD2. Oba para konstruktov sta se pri testiranju medsebojnega povezovanja in stabilnosti odrezala precej bolje, kot če so ju poskusili povezati z WT variabilnimi domenami.
Nato so preizkusili delovanje svojih konstruktov na celotnem IgG. VRD1 in VRD2 so kombinirali s CRD2 in ugotovili, da je v obeh primerih s kombiniranjem prišlo do bolj specifičnega in stabilnega povezovanja. Ugotovili so, da najboljše rezultate dobijo, če izražajo taka bispecifična protitelesa, pri katerih vsebuje ena polovica protitelesa mutacije VRD2 in druga VRD1_CRD2.
Sedaj so lahko preizkusili ali njihova metoda deluje tudi na realnih protitelesih, ki se uporabljajo v zdravstvu. S kombiniranjem šestih različnih monoklonskih protiteles so pripravili 5 bispecifičnih protiteles, ki bi bila potencialno bolj uporabna kot protitelesa z eno samo specifičnostjo. S testiranjem izražanja v celicah HEK293 so ugotovili, da se je ena polovica protitelesa večinoma izražala močneje kot druga, zato so morali transficirati večje količine plazmidov, ki so zapisovali za polovico z nižjo stopnjo izražanja. Pokazali so, da se taka protitelesa izražajo pravilno sestavljena, z malo neželjenimi produkti. Tudi stabilnost in farmakokinetične lastnosti (test na miškah BALB/c) so bile primerljive tistim, ki jih imajo WT monoklonska protitelesa.
Kljub temu, da so Lewis in sod. z načrtnimi mutacijami uspešno sestavili metodo za pripravo bispecifičnih protiteles v evkariontskih sistemih pa ta metoda, ravno zaradi teh mutacij, verjetno ne bo primerna za klinično uporabo. Vnesene mutacije bi namreč lahko predstavljale nove epitope na protitelesih, ki so imunogeni. Potrebno bo izvesti še dodatne raziskave, da se potrdi primernost takih protiteles za (klinično) uporabo.
