Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom
Uvod
Človeški imunski sistem je zmožen zaznati in (skladno) logično odreagirati na različne antigene in signale iz okolja. Takšno delovanje omogočajo različne imunske celice, ki so ob aktivaciji imunskega sistema sposobne oblikovati t.i. celični konzorcij ali združbo, v kateri vsaka celica opravlja svojo nalogo. Različne imunske celice lahko prepoznavajo specifične podvrste vhodnih in izhodnih signalov ter tako opravljajo specializirane funkcije. Poleg tega imajo celice tudi zmožnost neposredne medsebojne komunikacije s čimer dosežejo začasno koordinirane odzive, ki jih v celoti zaznamo kot imunski odziv. Natančnost v obdelavi signalov in komunikaciji med imunskimi celicami je nujno potrebna za doseganje homeostaze in preprečevanja bolezni. V namen izkoriščanja lastnega imunskega odziva za zdravljenje, so se razvile številne terapije, s katerimi poskušamo vplivati na zaznavanje signalov ali medcelične interakcije imunskih celic. Težava pa se pojavi, saj večina obstoječih imunoterapij ne zmore razlikovati med tarčami glede na kombinacijo več antigenov, hkrati pa vključujejo le posamezne tipe imunskih celic, kar omejuje njihovo uporabnost. Sposobnost vključevanja sinteznih kompleksnih logičnih vezij v človeške imunske celice in ustvarjanje celic s sposobnostjo porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije, lahko vodi v razvoj sintezne združbe imunskih celic, kar bi omogočilo bolj varno in učinkovito imunoterapijo [1]. Eden izmed načinov kako lahko ustvarimo takšne imunske celice je z uporabo SUPRA CAR sistema.
CAR in (SUPRA) CAR sistem
CAR
Himerni antigenski receptor ali CAR (angl. Chimeric antigen receptor) je sintezno načrtovan receptor, ki ga najpogosteje vnašamo v bolnikove limfocite T, s čimer omogočimo zdravljenje raka in drugih bolezni [2]. CAR sistem ima štiri glavne komponente: antigen-vezavno domeno, najpogosteje sestavljeno iz enoverižnega variabilnega fragmenta protiteles (scFv), vmesnik, transmembransko domeno in intracelularno signalno domeno T celičnega receptorja (CD3ζ) ter ko-stimulatornega receptorja (npr. CD28 ali 4-1BB). [1,3] Konvencionalni CAR sistemi delujejo tako, da po vezavi konstantnega antigen-specifičnega CAR, izraženega na bolnikovi T celici, na tarčni antigen, prihaja do simultane aktivacije konstantnih signalnih domen, kar vodi do celične proliferacije, sproščanja citokinov, metabolnih sprememb in citotoksičnosti [2,4]. CAR sistem je bil razvit z namenom preusmeritve bolnikove T celične specifičnosti proti rakavim celicam in s tem njihovo odstranitev. CAR sistem ima zelo visoko učinkovitost proti nekaterim vrstam raka, predvsem krvnim rakom, težava pa se pojavlja pri trdnih tumorjih, saj celice ne morejo prodirati v tumor [1,3]. Poleg tega oviro predstavlja tudi zasnova trenutno uporabljenih CAR T celic, ki je zelo rigidna in fiksna, zaradi česar je celice težko uravnavati, poleg tega pa je omejena tudi zmožnost kontroliranja stopnje aktivacije CART T celic in s tem celične toksičnosti. Fiksna zasnova prav tako omejuje antigensko specifičnost in afiniteto. Za zagotavljanje visoke antigenske specifičnosti se tako pogosto uporabljajo visoko afinitetni scFv, ki pa imajo omejeno sposobnost razlikovanja med antigensko gostoto, zaradi česar se lahko pojavi nevarna reaktivnost proti zdravim celicam, ki izražajo antigene v nizkih količinah. Posledično je zdravljenje s CAR T celicami povezano z razvojem sindroma sproščanja citokinov in nevrološko toksičnostjo [2].
SUPRA CAR
Da bi izboljšali in razširili uporabo CAR sistema so Wong in sodelavci leta 2018 razvili nov, razcepljen, univerzalen in programabilen (SUPRA) CAR sistem [2]. SUPRA CAR sistem je sestavljen iz dveh delov: univerzalnega receptorja (zipCAR), ki je izražen na T celicah ali drugih celicah imunskega sistema in scFv adaptorske molekule (zipFv), ki omogoča specifično ciljanje tumorjev. ZipFv molekula vsebuje levcinsko zadrgo in scFv, ki specifično prepozna želene antigene, ZipCAR pa je sestavljen iz intracelularne signalne domene in ekstracelularne levcinske zadrge, ki se specifično veže na zadrgo zipFv. Ob vezavi levcinskih zadrg, pride do povezave tarčnega antigena in zipCAR, izraženega na T celicah, kar povzroči celični odziv. SUPRA CAR sistem je sposoben izvajati različne funkcije kot je preklapljanja »ON/OFF«, uravnavanja T celične aktivacije in »IN« logično procesiranje signalov ter neodvisno kontroliranje različnih T celičnih podtipov in drugih imunskih celic [2].
Raziskava
Wong in sodelavci so želeli predstaviti in razširiti uporabnost SUPRA CAR sistema. S tem namenom so pripravili konstrukte zipCAR receptorja s pritrjevanjem različnih levcinskih zadrg na vmesnik, ki so ga združili s transmembransko in citoplazemsko regijo signalnih domen ter ko-stimulatornih domen; ko-inhibitornih domen; in NK aktivirajočih domen. Poleg tega so pripravili tudi zipFv konstrukte z različnimi scFv, pripetimi preko linkerja na levcinsko zadrgo, sorodno tisti na zipCAR. Tak sistem so nato vstavili v različne imunske celice pridobljenega in prirojenega imunskega sistema ter raziskovali nove možnosti doseganja logičnih odzivov [1].
Rezultati
a) SUPRA CAR celice lahko aktivirajo različne tipe celic pridobljenega in prirojenega imunskega sistema
Najprej so raziskovalci preučevali sposobnosti SUPRA CAR sistema, da preusmeri antigensko specifičnost v različnih T celičnih podtipih, NK celicah in makrofagih. S pomočjo merjenja citotoksičnega učinka celic in njihove citokinske produkcije, so ocenili inducibilnosti in logične operacije SUPRA CAR sistema. Izbrane celice so transducirali s pomočjo lentivirusov, tako, da so izražale zipCAR in jih ko-kultivirali z ali brez alfa-HER2 zipFv v prisotnosti HER2 izražajočih Nalm6 tarčnih celic. Glede na dobljene rezultate, SUPRA CAR sistem lahko učinkovito inducira ubijanje tarčnih celic preko CD8+ T celičnega odziva. Poleg tega so pokazali, da lahko SUPRA CAR sistem vključimo tudi v Th1 in Th2 celice, ki po dodatku zipFv izločajo INF- γ in IL-4, in v Treg celice, ki se po dodatku molekul zipFv aktivirajo. Ne le celice pridobljenega imunskega odziva, temveč tudi celice prirojenega imunskega odziva, kot so γδ T celice, NK celice in makrofagi, lahko služijo kot gostitelji za SUPRA CAR sistem in se ob dodatku zipFv ustrezno aktivirajo [1].
b) SUPRA CAR celice lahko kontrolirajo makrofagno polarizacijo preko CD4+ T celične aktivacije
Ortogonalni SUPRA CAR sistem lahko neodvisno regulira različne podtipe imunskih celic s čimer omogoča kontrolo aktivacije različnih tipov celic in določajo vrsto citokinov, ki jih celice proizvajajo. Učinek SUPRA CAR sistema so demonstrirali z indukcijo ortogonalnega zipCAR v Th1 in Th2 celice, tako da so le-te ob dodatkih različnih zipFv proizvajale citokine INF-γ, ki stimulira polarizacijo makrofagov M1, in IL-4, ki stimulira polarizacijo makrofagov M2. Poleg tega lahko različni tipi T celic, ki izražajo zipCAR otrogonalno in lokalno kontrolirajo odziv drugih imunskih celic [1].
c) SUPRA CAR celice se logično odzivajo na kombinatorne antigene v različnih celičnih tipih
Za izboljšanje specifičnosti prepoznavanja tumorskih celic je bilo že predhodno razvito »IN« logično vezje znotraj SUPRA CAR sistema v človeških CD4+ T celicah [2], z novo raziskavo pa so pokazali, da je takšno vezje funkcionalno tudi v CD8+ citotoksičnih celicah. »IN« logično vezje SUPRA CAR sistema so dosegli tako, da so dodali dva zipCAR sistema (FOS zipCAR in RR zipCAR), ki se vežeta na dva različna zipFv oziroma antigena, ter vsebujeta eden CD3ζ in drug ko-stimulatorno domeno. Tako je za aktivacijo sistema potrebna prisotnost dveh različnih antigenov. Podobno lahko intracelularno »IN« logično vezje deluje v različnih klinično pomembnih imunskih celičnih tipih [1].
d) Ko-inhibitorna signalna domena pridobljena iz BTLA omogoča »NE« logično vezje
Za raziskovanje »NE« logičnega vezja so naredili zbirko zipCAR glede na znane ko-inhibitorne receptorje. CD4+ in CD8+ T celice so nato transducirali s FOS zipCAR, ki je vseboval signalno in ko-stimulatorno domeno, ter RR zipCAR z različnimi inhibitornimi domenami. Najboljši učinek je imela aktivacija zipCAR z BTLA receptorjem, saj je prišlo do močnega zaviranja izražanja INF-γ v CD4+ T celicah. Do zmanjšanje citolizne aktivnosti CD8+ T celic ni prišlo, NK celice pa so imele zmanjšano aktivnost le za 40 odstotkov [1].
e) 3-vhodna logična vezja v celici z uporabo SUPRA CAR sistema
Poleg neodvisne uporabne »IN« in »NE« logičnega vezja, SUPRA CAR sistem omogoča tudi povezavo obeh vezij v eni sami celici [1].
f) SUPRA CAR lahko preusmeri Treg in Tconv odzive za simultano in logično kontrolo imunske aktivacije in supresije
SUPRA CAR sistem je aktiven tako v konvencionalnih kot tudi v regulatornih T celicah, kar omogoča logično reguliranje tako vnetja kot imunske supresije na inducibilen in antigensko odvisen način, preko koordinacije med celicami in porazdeljenega računalništva oziroma medcelične komunikacije[1].
g) Večcelični sistem stikala smrti
Sposobnost različnih imunskih celic, da regulirajo preživetje druga druge je pomemben sestavni del imunskega sistema, ki omogoča homeostazo in prepreči škodljive učinke prekomerno aktivnega imunskega odziva. Z željo po ustvarjanju sinteznega imunskega sistema, ki ima sposobnost neposrednega odstranjevanja sintetskih celic, so ustvarili CAR specifični celični sistem ubijanja tako, da so ciljali V5 epitop na zipCAR. CAR-NK celice so zasnovali tako, da lahko ob prisotnosti protitelesa proti V5 epitopu odstranijo CD8+ celice, ki izražajo zipCAR. To predstavlja enega izmed možnih načinov uravnavanja CAR T celično toksičnost [1].
h) Porazdeljeno računalništvo z medcelično komunikacijo omogoča nastanek združbe imunskih celic
Komunikacija med imunskimi celicami je zelo pomembna za pravilen imunski odgovor, zato so raziskovalci želeli ugotoviti kako lahko prilagodimo intracelularno komunikacijo za doseganje logičnih odzivov. Komponente SUPRA CAR sistema so lahko genetsko kodirane kar pomeni, da lahko kontroliramo ekspresijo zipFvs kot odgovor na imunsko celično aktivacijo, kar omogoča ustvarjanje ortogonalnega komunikacijskega sistema med tako ustvarjenimi imunskimi celicami [1].
Zaključek
Imunski sistem je kompleksen proces, zmožen zaznavanja različnih antigenov ter na osnovi vhodnih signalov opravljati kompleksne računske operacije in posledično oblikovati številne različne odzive. Razumevanje modulacije kompleksnih funkcij imunskega sistema predstavlja pomemben člen v razvoju novih imunoterapij. Prvi korak k razumevanju je predstavljen SUPRA CAR sistem, s pomočjo katerega lahko ustvarimo logične odzive in porazdeljeno računalništvo v različnih imunskih celičnih tipih. Konzorcij sinteznih imunskih celic, ki ga na ta način lahko ustvarimo, predstavlja nov mejnik v sintezni biologiji in celični terapiji.
Literatura
[1] J. H. Cho, A. Okuma, K. Sofjan, S. Lee, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Engineering advanced logic and distributed computing in human CAR immune cells,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–14, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21078-7.
[2] J. H. Cho, J. J. Collins, and W. W. Wong, “Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses,” Cell, vol. 173, no. 6, pp. 1426-1438.e11, May 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.03.038.
[3] S. Rafiq, C. S. Hackett, and R. J. Brentjens, “Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy,” Nature Reviews Clinical Oncology, vol. 17, no. 3. Nature Research, pp. 147–167, Mar. 01, 2020, doi: 10.1038/s41571-019-0297-y.
[4] R. C. Larson and M. V. Maus, “Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells,” Nature Reviews Cancer, vol. 21, no. 3. Nature Research, pp. 145–161, Mar. 01, 2021, doi: 10.1038/s41568-020-00323-z.
