Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji
V živilski industriji biokatalizatorji predstavljajo okolju prijazen način poteka biokemijskih reakcij z visoko specifičnostjo. Eni najbolj uporabnih encimov v biotehnologiji in živilski industriji so mikrobne lipaze, predvsem lipaze ekstremofilnih mikroorganizmov. Lipaze so pokazale velik potencial za sintezo kratkoverižnih estrov, ki so uporabni v živilski industriji kot ojačevalci okusa in aromatske spojine. Termo-halofilne lipaze so zaradi svojih posebnih značilnosti dobra izbira za aplikacijo v industriji, kjer so pogosto prisotni ekstremni pogoji. V članku je predstavljena termo-halofilna lipaza iz bakterije Rhodothermus marinus, katere gen so klonirali v E. coli. R. marinus je ekstremofilna (termo-halofilna) bakterija, ki raste med 54 in 77 °C in pri koncentracijah NaCl od 0,5- 6 %.
Izražanje RD lipaze v E. coli
Z metodo PCR so pomnožili gen za RD lipazo iz R. marinus, ga klonirali v izbrani plazmid in nato plazmid transformirali v E. coli. Izražanje lipaze so sprožili z dodatkom reagenta IPTG v gojišče. Za izolacijo encima so uporabili afinitetno kromatografijo. Pri izolirani lipazi so določali biokemijske in strukturne karakteristike. Poleg tega so encim uspešno imobilizirali na magnetne nanodelce Fe3O4 prekrite s hitozanom in okarakterizirali še lastnosti vezane lipaze.
Prosta (nevezana) lipaza
Rekombinantna lipaza kaže hidrolitično aktivnost z vsemi testiranimi substrati (p-nitro fenilni estri z različnimi dolžinami verig), toda preferira estre kratkoverižnih maščobnih kislin in kaže najvišjo aktivnost s p-nitrofenil butiratom. Opaženi potencial selektivne hidrolize lahko predstavlja pomembno prednost v številnih industrijah, nastale kratkoverižne maščobne kisline pa lahko služijo kot prekurzorji vonjev in arom. Optimalna temperatura za delovanje lipaze je 70 °C, pri kateri po 60 minutni inkubaciji ohrani kar 78 % svoje prvotne aktivnosti. Encim je pokazal dobro hidrolitično aktivnost v pH območju 7,5 -10, z optimalno aktivnostjo pri pH 8,5. Optimalna koncentracija NaCl za aktivnost lipaze je pri 0,2 M NaCl, kar poveča njeno aktivnost na 130 %. Preučevali so tudi vpliv različnih kovinskih ionov na lipazno aktivnost. Aktivnost je bila povečana ob dodatku Na+, K+ in Mg2+ ionov in zmanjšana ob dodatku Fe2+ ionov. Kompatibilnost s kovinskimi ioni je pomembna za aplikacijo lipaz v industriji detergentov. Preučevana lipaza kaže tudi dobro stabilnost v prisotnosti najbolj uporabljenih organskih topil, saj ohrani več kot 90 % maksimalne aktivnosti v prisotnosti acetona, acetonitrila, izoamil-alkohola, n-heksana in kloroforma. Njena aktivnost se ob prisotnosti etanola in metanola še poveča, kar kaže na stimulativen učinke omenjenih topil. Stabilnost v organskih topilih je bistvenega pomena pri sinteznih reakcijah, zato ima RD lipaza potencial biokatalizatorja za organsko sintezo.
Lipaza, imobilizirana na magnetne nanodelce Fe3O4, prekrite s hitozanom
Po 60 minutni inkubaciji pri temperaturah nad 60 °C je bila zaznana občutna razlika v aktivnosti med prostim in imobiliziranim encimom. Aktivnost imobiliziranega encima po 60 minutni inkubaciji na 80 °C se je zmanjšala le za 8 %, medtem ko je aktivnost prostega encima padla za kar 65 %. Imobilizacija očitno lahko poveča temperaturno in pH stabilnost lipaze in zato predstavlja dobro uveljavljen način za zaščito strukture in aktivnosti encima. Ena najpomembnejših posledic imobilizacije je podaljšanje stabilnosti encima pri skladiščenju. Imobiliziran encim po 14 dnevnem skladiščenju izgubi le 20 % aktivnosti in celo po 20 ciklih ohrani približno 80% začetne aktivnosti. Iimobilizirana lipaza ima visoko tendenco za proizvodnjo kratkoverižnih estrov in zato predstavlja dobrega kandidata za sintezo kratkoverižnih aromatskih estrov kot je metil acetat. Donos esterifikacije pri nastanku metil acetata z imobilizirano lipazo je kar 67 %.
Zaključek
Ekstremofilni encimi, predvsem lipolitične hidrolaze, kažejo visoko aktivnost pod zaostrenimi pogoji in zato predstavljajo okolju prijazne katalizatorje za organsko sintezo. Lipaza iz R. marinus kaže visok potencial za hidrolizo in sintezo kratkoverižnih estrov, kar bi se lahko izkoristilo za izboljšanje mlečnih produktov in sintezo arom. Visoka termostabilnost, dobra odpornost na organska topila in alkalofilen značaj pa dajejo lipazi možnosti za uporabo v živilski in farmacevtski industriji ter industriji detergentov.
