Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov

Uvod

Maščobne kisline (m. k.) in njihovi derivati so sestavne komponente vseh organizmov. Po navadi se v telesu nahajajo v obliki derivatov maščobnih kislin kot so acil-ACP, acil-CoA, eikozanoidi in lipidi ter v majhnih količinah tudi v prosti nezaestreni obliki. So visokoenergetske molekule in služijo kot gorivo za naše celice, kot toplotna izolacija pri živalih in ljudeh, kot topilo za življenjsko pomembne vitamine ter kot strukturna komponenta celičnih membran. Pri nekaterih vodnih živalih (kit) so pomembne tudi kot adaptacija na gostoto vode. Kemijsko so maščobne kisline karboksilne kisline z dolgim alifatskim repom, ki je lahko nasičen ali nenasičen. Sintetizirajo se v citosolu po poti de novo, kjer je acetil-CoA izhodna spojina, ki nastane z oksidacijo piruvata. V naslednji stopnji acetil-CoA karboksilaza katalizira tvorbo malonil-CoA; ta korak je ireverzibilen in zagotovi, da poteče sinteza m. k. Razgradnja m. k. poteka v procesu beta oksidacije, ki poteka v mitohondriju.

Uporaba derivatov maščobnih kislin

Proste maščobne kisline v industriji niso direktno uporabne zaradi ionskega značaja karboksilne skupine, vendar so zato toliko bolj uporabni derivati maščobnih kislin. Derivati m. k. so vse oblike maščobnih kislin, ki nimajo več proste karboksilne skupine. Lahko se jih pridobiva iz naravnih virov in sicer iz rastlinskih in živalskih maščob, vendar je vsebnost derivatov m. k. majhna in izolacija zahtevna. Najpogosteje uporabljana je kemična sinteza, vendar jo zaradi slabe učinkovitosti, ostrih reakcijskih pogojev in drage opreme počasi nadomešča alternativno pridobivanje surovin s pomočjo bioreaktorjev. Poleg tega, da izvzemajo večino slabosti kemične sinteze, so bioreaktorji tudi bolj prijazni okolju (Zhou, Buijs, Siewers, & Nielsen, 2014). Derivate maščobnih kislin (m. k.) se uporablja v farmacevtski, kozmetični in strojni industriji. Metilni in etilni estri maščobnih kislin se uporabljajo kot biogoriva, z namenom, da bi lahko nekoč nadomestili vse bolj omejeno količino fosilnih goriv (primer je biodizel v obliki etilnih estrov maščobnih kislin (angl. fatty acid ethyl esters – FAEE), ki je dober nadomestek dizelskega goriva zaradi nizke topnosti v vodi in velike energijske gostote, hkrati pa FAEE niso toksični za gostiteljske mikrobne sisteme (Zhang, Carothers, & Keasling, 2012)). Maščobni alkoholi so uporabni kot detergenti, surfaktanti in topila, pa tudi kot bioplastika (Lu et al., 2012), hidroksi maščobne kisline (maščobne kisline z eno ali več hidroksi skupinami, so v rastlinah in živalih) pa so pomembni materiali v kemični, prehrambeni in kozmetični industriji, kažejo pa tudi pomembno vlogo kot signalne molekule v raznih človeških boleznih (Kim & Oh, 2013). Industrijsko uporabni derivati so tudi alkani, alkeni, aldehidi, ketoni in laktoni.

Mikroorganizmi za pripravo kemikalij iz derivatov maščobnih kislin

Čeprav mnogi mikroorganizmi sami proizvajajo in kopičijo maščobne kisline in njene derivate, se za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin najpogosteje uporabljata E. coli in S. cerevisiae. Obe se intenzivno preučujeta in uporabljata za pridobivanje heterolognih industrijsko uporabnih produktov. Prednosti njune uporabe so hitra rast, nizek nivo tveganja, možna industrijska uporaba in uveljavljene metode sledljivosti produktov. Perspektivni mikoorganizmi, ki že vsebujejo znatno količino prekurzorjev maščobnih kislin, so t.i. oljni mikroorganizmi (angl. Oleaginous microorganisms). Sem spadajo bakterije, kvasovke, cianobakterije, mikroalge in filamentozne glive. Oljni mikroorganizmi lahko kopičijo veliko količino intracelularnih lipidov, t.j. vsaj do 20 % njihove suhe celične mase. Oljne bakterije so zaradi najmanjše vsebnosti lipidov najmanj raziskane, na drugi strani pa so zaradi sposobnosti fotosinteze zelo zanimive cianobakterije in mikroalge. Največ prednosti izkazujejo oljne kvasovke, saj so enostavne za gojenje in zrastejo do velikih celičnih gostot, njihov delež lipidov je visok in znaša okoli 70 % suhe celične mase, poleg tega pa lahko za sintezo derivatov maščobnih kislin uporabijo velik nabor nutrientov iz odpadnega materiala. Nekatere oljne kvasovke, ki so potencialno uporabne za pridobivanje kemikalij iz derivatov maščobnih kislin, so Yarrowia lipolytica, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toru- loides. Y. lipolytica velja za model oljne kvasovke, saj je zmožna porabe širokega nabora substratov in za rast potrebuje enostavne vire ogljika. V primerjavi s S. cerevisiae ima večji delež lipidov in kaže boljšo sintezo heterolognih proteinov. Kljub obetavnim rezultatom, ki zajemajo sintezo trigliceridov, laktonov, hidroksi maščobnih kislin in polinenasičenih maščobnih kislin, je potrebno kvasovko Y. lipolytica še nadalje raziskati.

Pridobivanje kemikalij iz derivatov maščobnih kislin

1. Spreminjanje metabolnih poti

S spreminjanjem metabolnih poti (t.i. metabolno inženirstvo) so ustvarili bioreaktorje za najrazličnejše industrijsko pomembne spojine. Da bi pripravili zdravila, nove proteine in druge kemikalije, lahko v gostiteljski organizem uvedemo heterologne gene, ki zapisujejo za pomembne encime v sintezni poti. S pomočjo metabolnega inženirstva bi tako lahko ustvarili tudi industrijsko pomembne molekule iz prostih maščobnih kislin in njihovih derivatov. V E. coli in S. cerevisiae so že uspeli pridobiti metilne in etilne estre maščobnih kislin, maščobne akohole, butanol, traicilglicerole, alkane, hidroksi maščobne kisline, laktone in metil ketone. Metilne estre m. k. so pridobili v E. coli z ekspresijo heterolognih genov za maščobnokislinsko metiltransferazo (iz Mycobacterium marinum in Mycobacterium smegmatis), ki katalizira reakcijo nastanka FAME iz prostih m. k. in S-adenozilmetionina. Za pripravo etilnih estrov m. k., ki so jih pridobili v E. coli in S. cerevisiae, so se morali poslužiti več korakov; vnos heterolognih genov za wax sintazo, delecija genov za encime, ki sodelujejo v konkurenčnih biokemijskih poteh (beta oksidacija in sinteza triacilglicerolov (TAG)) in povečana ekspresija endogenega proteina, ki veže acil-CoA, ter nativne acil-ACP tioesteraze. Pri E. coli je izkoristek sinteze derivatov m. k. v primerjavi s S. cerevisiae veliko večji. Vendar S. cerevisiae odlikuje velika prednost; ker gre za evkariontski ekspresijski sistem, je veliko bolj primerna za izražanje in pridobivanje evkariontskih heterolognih proteinov. Predvsem v metabolizmu maščobnih kislin je mnogo rastlinskih genov, ki zapisujejo za encime. Velika ovira pri uvedbi sprememb v korakih metabolnih poti je še vedno kompleksnost sistema. Težko je predvideti vse možne spremembe zaradi medsebojnih povezav in povratnih zank. Kljub temu, da so uspeli pripraviti derivate m. k. že v mnogih mikroorganizmih, je še vedno velik izziv pridobivati produkte v velikih količinah, kar je sicer pogoj za industrijsko uporabne bioreaktorje. Največje prepreke, ki otežujejo produktivnost takih bioreaktorjev, so nizka učinkovitost encimov v metabolni poti, slaba toleranca mikroorganizma na potencialne toksične produkte, neučinkovit dovod kofaktorjev, ki so nujni za delovanje encimov, odstranjevanje stranskih produktov in slaba optimizacija povratnih zank.

2. Spreminjanje metabolnih poti s sintezno biologijo

Z manipulacijo metabolnih poti so že uspeli pripraviti derivate maščobnih kislin v različnih mikroorganizmih, vendar bi lahko s pomočjo sintezne biologije izboljšali tako produktivnost kot titer. Najbolj idealno bi bilo združiti nove ideje s področja sintezne biologije z že uspešnimi pristopi inženiringa metabolnih poti. Na ta način bi lahko optimizirali biokemijske procese na vseh ravneh od DNA do končnega produkta. DNA inženiring je prvi korak, ki ga spreminjamo pri načrtovanju novih/prilagojenih metabolnih poti. Lahko kombiniramo heterologne gene za encime, ki sodelujejo v sintezni poti, lahko določene gene za encime nadomestimo, odstranimo ali dodamo. Klasično kloniranje, ki zajema sintezo genov (PCR), restrikcije in ligacije, je časovno potratno v primerjavi z novimi pristopi kloniranja: za sintezo novega gena se lahko poslužimo sinteze de novo, kjer za razliko od PCR ne potrebujemo matrice, rezanje in lepljenje genov pa je zdaj možno tudi brez restriktaz in ligaz. Vse pogosteje se uporabljajo tudi protokoli za enostavno sestavljanje bioloških delov kot sta npr. sistem sestavljanja BioBrick in BglBrick. Enostavnost sistema BioBrick je hkrati tudi njegova pomanjkljivost, saj nastanek brazgotine, ki je posledica previsnih koncev, potem ko režemo z restriktazama XbaI in SpeI, onemogoča direktno fuzijo proteina s signalnim peptidom ali katero drugo oznako. Sistem BglBrick ima to pomanjkljivost odpravljeno, saj pri tem načinu režemo z BglII in BamHI, brazgotina, ki nastane, pa kodira za glicin-serin (Anderson et al., 2010). Nekatere druge metode hitrega sestavljanja DNA so mikrofluidni čipi, sistem sestavljanja In-Fusion, Gibson in Tar, SLIC, SLiCE, id.. Te metode omogočajo hitro sintezo poljubno dolgih DNA fragmentov. Izražanje genov lahko uravnavamo že na ravni transkripcije. Z izbiro mesta začetka podvojevanja na ekspresijskem vektorju (plazmidu), ki nosi zapis za izbrani gen, določimo število kopij gena in z izbiro promotorja prilagajamo transkripcijsko aktivnost v gostiteljskem organizmu. Tudi na tem področju je že steklo nekaj raziskav. V E. coli so pripravili dinamični senzorno-regulatorni sistem za pripravo biodizla. Senzor je transkripcijski faktor FadR, ki je vezan na promotor in preprečuje vezavo RNA polimerazi. Ko se nanj veže intermediat acil-CoA (antagonist), se kompleks ligand-TF odstrani in RNA polimeraza lahko prepiše zapis za reporterski protein. Vse skupaj je regulirano tako, da se lahko acil-CoA veže samo, kadar so v sistemu m. k. (Zhang et al., 2012). Intenzivno se razvijajo tudi pristopi za regulacijo izražanja na ravni translacije. Z uvedbo sintetičnih RBS-jev, protismernih RNA, ribocimov, peptidnih oznak in rabe kodona v veliki meri vplivamo na hitrost translacije in degradacijo proteinov.

Zaključek

Potreba po derivatih m. k. je v svetu velika. Na pomembnost spojin kažejo mnoge raziskave na tem področju. Samo metabolni inženiring ne prinaša optimalnih rezultatov in ga je potrebno optimizirati. Najboljše rezultate dajejo raziskave, kjer pomanjkljivosti metabolnega inženiringa izboljšajo z metodami sintezne biologije. Z uvajanjem in preizkušanjem vseh možnih optimizacijskih procesov smo tako bližje industrijski uporabi bioreaktorjev.

Viri

Acid, U. F. (1955). Unesterified fatty acid, 206–212.

Anderson, J. C., Dueber, J. E., Leguia, M., Wu, G. C., Goler, J. a, Arkin, A. P., & Keasling, J. D. (2010). BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. Journal of Biological Engineering, 4(1), 1. http://doi.org/10.1186/1754-1611-4-1

Kim, K., & Oh, D.-K. (2013). Production of hydroxy fatty acids by microbial fatty acid-hydroxylation enzymes. Biotechnology advances (Vol. 31). Elsevier B.V. http://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.07.004

Lu, W., Ness, J. E., Xie, W., Zhang, X., Liu, F., Cai, J., … Gross, R. a. (2012). Biosynthesis of monomers for plastics from renewable oils. ACS Symposium Series, 1105(20), 77–90. http://doi.org/10.1021/bk-2012-1105.ch006

Zhang, F., Carothers, J. M., & Keasling, J. D. (2012). Design of a dynamic sensor-regulator system for production of chemicals and fuels derived from fatty acids. Nature Biotechnology, 30(4), 354–359. http://doi.org/10.1038/nbt.2149

Zhou, Y. J., Buijs, N. a, Siewers, V., & Nielsen, J. (2014). Fatty acid-derived biofuels and chemicals production in Saccharomyces cerevisiae Fatty acid-derived biofuels and chemicals production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2(September), 1–6. http://doi.org/10.3389/fbioe.2014.00032