Proizvodnja zunajceličnega matriksa

UVOD

Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:

• blokiranje fagoreceptorjev,
• proizvodnja zunajceličnega matriksa,
• proizvodnja inhibitorjev adhezije.

Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju: ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.

KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU

[1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi.

• Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov.

• Proteinske komponente

Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo Bacillus subtilis. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice.

• Zunajcelična DNA (eDNA)

Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice.

• Lipidi

ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne.

• Voda

Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.

SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA

• Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]

Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija Pseudomonas aeruginosa PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju: c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo.

• Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]

Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije P. aeruginosa PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.

• Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]

Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. S. aureus surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.

PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV

Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3].

Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine:

• biomedicinska uporaba fagov,
• ekologija fagov,
• interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4].

Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3]. Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:

• EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:
  • Hidrolaze (polisaharaze)
  • Liaze

Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze cepijo glikozidne vezi.

• Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo bakterijskih celic (liza od znotraj)[5].
• Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti lizo od zunaj, s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].

Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].
[3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov.
Primer:

• Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.
• Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze.
• Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo bakterijskih celic in EPS degradacijo ter s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.
• Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-D-glukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira β-1,6-N-acetilD-glukozamin, ki je ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov.

[3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.

VIRI

[1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.
[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.
[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.
[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.
[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.