RNA-vezavni proteini kot terapevtske tarče pri zdravljenju raka

Uvod

Vsako leto je na svetu diagnosticiranih preko 20 milijonov novih primerov raka. Zaradi velikih razlik med posameznimi primeri in vrstami raka poskuša razvoj terapij izkoristiti vse možne celične mehanizme, ki kakorkoli sodelujejo pri kancerogenezi. Dober potencial za tarčenje imajo RNA-vezavni proteini. Ti sodelujejo v vseh fazah ekspresije genov, hkrati pa pomagajo pri tvorbi brezmembranskih kompartmentov in celični signalizaciji. Trenutno poznamo že več kot 4000 takšnih proteinov. Njihovo tarčenje pa ni tako enostavno, kot se zdi na prvi pogled. Večina nima velikih hidrofobnih žepov za vezavo malih molekul. Večinoma imajo v strukturi neurejene regije, urejene domene pa so si med seboj homologno podobne. Hkrati pa so multifunkcionalni in je težko predvideti, kako bo njihovo utišanje vplivalo na celico. Kljub temu pa je v razvoju nekaj obetavnih mehanizmov, kako tarčiti te proteine. V nadaljevanju so predstavljeni pristopi: inhibitorne male molekule, protismerni oligonukleotidi, aptameri, peptidi in »molekularna lepila«.

eIF4F in male inhibitorne molekule ter protismerni nukleotidi

Evkariontski iniciacijski faktor eIF4F je RNA-vezavni protein, ki je sestavljen iz podenot eIF4A, eIF4E in eIF4G. Celoten kompleks je pri rakavih obolenjih pogosto nepravilno reguliran in je zato pomembna tarča zdravljenja. Največkrat so zdravljenja usmerjena v regulacijo delovanja podenote eIF4E, od katere so rakave celice močno odvisne, zdrave celice pa je za preživetje nujno ne potrebujejo. Prvi način za zmanjšanje delovanja eIF4E je preko zaviranja translacije njegove mRNA z uporabo protismernih nukleotidov (ISIS 183750 in LY2275796), ki povzročijo nastanek DNA-RNA hibrida, ki ga prepozna RNasa H in sproži razgradnjo RNA. Čeprav so bile terapije z njimi dobro tolerirane in so uspešno znižale količino eIF4E v krvi, zadostnih rezultatov ni bilo. Drugi način za zmanjšanje delovanja eIF4E je preprečitev vezave eIF4E na 5' kapo mRNA. Uporabljata se inhibitorja Ribavirin in njegov derivat TRX-201, ki po strukturi posnemata 5' kapo in se vežeta na eIF4E, ki posledično ne more več interagirati z mRNA. Ribavirin se je izkazal za učinkovitega v zgodnjih kliničnih testiranjih pri bolnikih z akutno mieloično levkemijo. Za iniciacijo translacije je ključna tudi povezava eIF4E z eIF4G. Rakavo transformacijo celic zato lahko zaviramo tudi s preprečitvijo povezave teh dveh proteinov. Uporabimo male inhibitorne molekule (4EGI-1, 4E1RCat in 4E2RCat), ki so se izkazale za učinkovite v različnih vrstah raka in lahko celo pomagajo pri kemorezistenci. Na enak način delujeta tudi ouabain in perilil alkohol, ki pa še nista bila klinično testirana. Nekatere raziskave pa so se usmerile v preprečitev fosforilacije eIF4E, ki povzroča dodatno onkogeno aktivnost. Fosforilacijo izvajajo kinaze MNK (angl. MAPK interacting serine/threonine kinases), katerih inhibitorja sta Cercosporamid in Tomivosertib. Cercosporamid še ni bil preizkušen v kliničnih študijah, Tomivosertib pa v drugi fazi kliničnih študij pri raku pljuč ni pokazal zadostnih učinkov. Poleg eIF4E je pomembna tarča zdravljenja tudi helikaza eIF4A, ki odvija strukturo 5’UTR, kar omogoča vezavo ribosoma in začetek translacije. Raziskovani so bili mnogi eIF4A inhibitorji, ki vodijo v zmanjšano proliferacijo. Med njimi je prednost za klinične študije dobil Zotatifin, ki translacijo inhibira s stabilizacijo vezave eIF4A na polipurinska zaporedja v 5'UTR mRNA.

m6A demetilaza FTO in male inhibitorne molekule

Naslednja izjemno obetavna tarča za zdravljenje raka je FTO protein (angl. Fat mass and obesity-associated protein). FTO ima vlogo pri regulaciji telesne mase, metabolizma, razvoja živčnega sistema in raka in deluje kot onkogen v različnih vrstah raka, kjer je pogosto prekomerno izražen. FTO je m6A demetilaza, ki torej odstranjuje metilne skupine z N6 pozicije adenozina na RNA molekuli, s čimer molekulo RNA vrne v nemodificirano obliko. Ta reverzibilnost omogoča precizno in časovno usklajeno regulacijo ekspresije genov na posttranskripcijski ravni, saj se poveča stabilnost mRNA onkogenov, kar pomaga celicam preživeti, deliti se, izogibati se imunskemu sistemu in postati odporne na zdravljenje in s tem spodbuja rast tumorjev. Na molekularni ravni utišanje ali inhibicija FTO preprečuje samoobnavljanje rakavih matičnih celic, kar oslabi presnovo rakavih celic, učinkovito zavira napredovanje tumorja, ter izboljša odziv rakavih celic na terapevtska zdravila. Raziskave so že razvile male inhibitorne molekule (SMI), ki specifično zavirajo katalitično aktivnost FTO. Ena izmed teh je FB23–2, derivat meklofenaminske kisline, ki je v mišjih modelih z vstavljenimi človeškimi rakavimi celicami upočasnil ali zavrl rast akutne mieloblastne levkemije (AML). Toda za učinkovito zaviranje FTO je potrebna relativno visoka koncentracija FB23–2 , kar ni idealno, saj lahko to povzroči stranske učinke ali zmanjšano selektivnost. Nedavno pa so odkrili dve izjemno učinkoviti SMI, bisantren in brekinar, ki interagirata s ključnimi ostanki FTO, ki sodelujejo pri vezavi na mRNA in za učinkovito zaviranje so dovolj tudi nižje koncentracije. V študijah sta pokazala močne protitumorske učinke tako in vitro kot in vivo pri zdravljenju AML, ob minimalni toksičnosti tudi pri visokih odmerkih.

SF3B1 in male inhibitorne molekule

Naslednji obetavni terapevtski pristop je usmerjen na podenoto 1 esencialnega spojitvenega faktorja 3B oz. SF3B1(angl. Splicing factor 3B subunit 1 ), ki je ključen del izrezovalno-povezovalnega kompleksa oz. spajalnega telesca in omogoča prvi korak v procesu izrezovanja intronov. SF3B1 je najpogosteje mutiran faktor v človeškem raku in spremembe v izbiri spajalnih mest zaradi mutacije vodijo v bolj agresivno bolezen in krajše preživetje. Testiranje pri obeh derivatih naravnih zaviralcev SF3B1, E7107 in H3B–8800, je bilo prekinjeno, zaradi hudih stranskih učinkov pri enem in nezadostne učinkovitosti pri drugem, kar poudarja potrebo po novih, učinkovitejših in varnejših zaviralcih SF3B1, ki je zaradi svoje pomembnosti še vedno obetavna terapevtska tarča.

RBM39 in molekularna lepila

Prominenten terapevtski potencial v boju proti raku kaže tudi RNA vezavni protein RBM39 oz. protein 39 z RNA-vezavnim motivom. To je 530 aminokislinskih ostankov dolg protein, ki ima v svoji strukturi RS oz. arginin-serin domeno, dve kanonični RRM domeni oz. RNA prepoznavna motiva ter eno nekanonično, ki jo imenujemo tudi UHM domena oz. U2AF homologni motiv. Slednja je strukturno podobna RRM domeni, vendar namesto RNA veže ULM motive oz. UHM ligand motive, ki so pogosto del izrezovalnih faktorjev. RBM39 v celici primarno sodeluje v procesih transkripcije, translacije in procesiranja. Veže se lahko na različne transkripcijske faktorje ali na njihove aktivirajoče proteine. Interagira tudi s koaktivatorjem ASC-2, ki stimulira še ostale proteine z RRM domenami. Med procesom translacije vpliva preko vezave na 5'UTR, kar dokazano pomaga pri povišanju izražanja proteinov. Večina njegovih rakotvornih lastnosti pa izhaja iz delovanja kot izrezovalni faktor. U2snRNP vsebuje ULM domeno, na katero se RBM39 veže preko UHM domene. Ker je UHM na C koncu, ima še vedno prosti obe RRM domeni ter RS domeno. Po vezavi lahko deluje podobno kot pomožni faktor U2AF65, torej se lahko direktno veže na RNA ali aktivira ostale izrezovalne faktorje za specifično alternativno izrezovanje. Tako lahko uravnava alternativno izrezovanje intronov, saj lahko aktivira izrezovalne faktorje, ki prepoznajo tudi šibkejša 3' izrezovalna mesta. Ni še povsem pojasnjeno, pri katerih vseh mRNA transkriptih sodeluje RBM39, je pa že več študij pokazalo korelacijo med povišanim izražanjem in kancerogenezo. Zaenkrat jim je to uspelo pokazati v primeru raka na prsih, akutni mieloblastni levkemiji, raku na pljučih in plazmacitomu. Prav tako so pokazali obratno korelacijo, torej anti-proliferativni učinek na rakave celice, če so v njih zmanjšali stopnjo izražanja RBM39. Ker RBM39 ni encim, ga ne moremo preprosto utišati z dodatkom inhibitorja. Alternativni način bi lahko bil usmerjena ubikvitinacija in proteasomska razgradnja tega proteina, vendar je bilo to dolgo težko dosegljivo, ker RBM39 v svoji strukturi ne vsebuje dobro definiranega žepa za vezavo kompleksa E3 ubikvitin ligaze. Tak mehanizem bi bil zelo učinkovit, ker imajo tumorske celice že naravno povišano izražanje ubikvitin ligaz in bi s tem izkoristili naravni odziv celic. Rešitev ponuja spojina indisulam, disulfonamid s kloroindolnim in benzenovim obročem. Med študijami o vplivu sulfonamidov na inhibicijo progresije raka je celice uspešno zadržal na točki G1-S v celičnem ciklu. Naknadno so ugotovili, da to stori prav preko vplivanja na ubikvitinacijo RBM39 in sicer da deluje kot molekularno lepilo med RBM39 in DCAF15, ki je sestavni protein kompleksa E3 ubikvitin ligaza. Molekularna lepila so male molekule, ki preko vezave povečajo afiniteto med dvema proteinoma, ki se sicer med seboj ne bi povezala. RBM39 preko RRM2 domene sicer tvori nekaj interakcij z DCAF15, vendar je večina teh nepolarnih in niso dovolj močne, da bi kompleks obstal do ubikvitinacije. Indisulam poveže centralno alfa vijačnico RRM2 domene ter trakova beta-9, beta-16 in vijačnico alfa-6 v DCAF15. Večina vezi poteka preko kloroindolnega heterocikla, ki tvori polarne interakcije preko heteroatomov in pi interakcije preko indola. Dobra lastnost indisulama je visoka specifičnost za ta proteina, saj se tvori vezi na specifične stranske verige aminokislinskih ostankov in ne na ogrodje proteina. Med testiranjem ostalih aromatskih sulfonamidov so se kot molekularna lepila za RBM39 izkazali tudi E7820, tasisulam in klorokinoksalin sulfonamid, ki jih s skupnim imenom označujemo kot SPLAM oz. izrezovanje inhibitorni sulfonamidi. Indisulam in E7820 sta trenutno v fazi 1 in fazi 2 več kliničnih študij in kažeta dober varnostni profil za človeka.

Nukleolin in aptameri ter peptidi

Pomemben terapevtski pristop je postal tudi usmerjanje na multifunkcijski protein nukleolin s pomočjo aptamerov in peptidov. Nukleolin ima medrugim pomembno vlogo pri organizaciji kromatina, metabolizmu RNA in signalizaciji. V številnih tumorjih je nukleolin prekomerno izražen na površini rakavih celic, kjer deluje kot receptor za ligande, vključene v angiogenezo, proliferacijo, preživetje celic in metastaziranje. Zaradi selektivne prisotnosti na plazemski membrani rakavih celic in vpliva na napredovanje tumorjev je nukleolin izjemno zanimiva tarča za zdravljenje raka z obetavno specifičnostjo. Kompleksna struktura nukleolina je primerna za razvoj, kratkih enoverižnih nukleinskih kislin, DNA oligonukleotidov, zasnovanih za visokoafinitetno vezavo na ciljni protein, ki jim pravimo aptameri. AS1411 je 26-nukleotidni, z gvaninom bogat, DNA aptamer, ki tvori stabilen G-kvadrupleks. Po vezavi se kompleks AS1411 in nukleolina premakne z zunanjosti celice v notranjost, kar zmanjša vezavo nukleolina na mRNA, ki kodira antiapoptotski faktor Bcl-2, in tako destabilizira Bcl-2 mRNA ter sproži apoptozo. AS1411 je bil preizkušen v več II. fazah kliničnih študij in je bil splošno dobro prenašan, vendar je kot monoterapija pokazal omejeno učinkovitost, v kombinaciji z antitumorskim zdravilom citarabin pa je terapevtski odziv izboljšan. Ker AS1411 pripomore k povečanem selektivnem vstopu v rakave celice, se uporablja tudi za ciljno dostavo zdravil, s čimer povečamo usmerjenost in specifičnost zdravljenja na rakave celice. Vzporedno pa potekajo tudi komplementarni pristopi, ki temeljijo na inhibiciji nukleolina s sintetičnimi peptidi, kot je na primer psevdopetid IPP-204106 (N6L), ki je trenutno v II. fazi kliničnih študij.

Zaključek

RNA-vezavni proteini so odlične terapevtske tarče, saj obstaja veiko različnih pristopov kako učinkovati na njih. Ker igrajo zelo različne vloge v različnih vrstah in fazah raka, bi lahko omogočali tudi bolj personalizirane pristope zdravljenja. Poleg tega je tako zdravljenje združljivo s kemoterapijo in imunoterapijo, v nekaterih primerih pa lahko celo pripomore k njuni učinkovitosti ali pa zavira kemorezistenco. Pri zdravljenju moramo biti še posebej pazljivi, kako vplivamo na RNA-vezavne proteine, ki so potrebni za normalno delovanje zdravih celic. V tem primeru je najboljši pristop prepoznavanje specifičnih markerjev na površini rakavih celic, ki omogočajo večjo specifičnost. Novi načini za prepoznavanje takih markerjev se hitro razvijajo, trenutno pa se uporabljajo predvsem nanodelci. Zaenkrat večina študij na tem področju poteka na celičnih kulturah, vendar bi bilo potrebno raziskovanje tudi na naprednejših modelih kot so tkivne kulture, organoidi in organi na čipu (angl. organ-on-chip model) , kar bi omogočilo boljši vpogled v dejansko delovanje RNA-vezavnih proteinov v organizmu.

Viri

Jungfleisch, Jennifer, in Fátima Gebauer. 2025. „RNA-Binding Proteins as Therapeutic Targets in Cancer“. RNA Biology 22 (1): 1–8. https://doi.org/10.1080/15476286.2025.2470511. Niu, Y., Lin, Z., Wan, A. et al. 2019. „RNA N6-methyladenosine demethylase FTO promotes breast tumor progression through inhibiting BNIP3”. Mol Cancer 18, 46. https://doi.org/10.1186/s12943-019-1004-4 Xu, Caipeng, Xiaohua Chen, Xuetian Zhang, Dapeng Zhao, Zhihui Dou, Xiaodong Xie, Hongyan Li, idr. 2021. „RNA-Binding Protein 39: A Promising Therapeutic Target for Cancer“. Cell Death Discovery 7 (1): 214. https://doi.org/10.1038/s41420-021-00598-7. Zhou, Z., Gong, Q., Wang, Y. et al. .2020. „The biological function and clinical significance of SF3B1 mutations in cancer”. Biomark Res 8, 38. https://doi.org/10.1186/s40364-020-00220-5 Martineau, Y, R Azar, C Bousquet, and S Pyronnet. 2012. “Anti-Oncogenic Potential of the eIF4E-Binding Proteins.” Oncogene 32 (6): 671–77. https://doi.org/10.1038/onc.2012.116..