RNA interferenca in uporaba v agrikulturi

Uvod

V zadnjih desetletjih so vse večje skrbi zaradi negativnega vpliva klasičnih insekticidov na okolje spodbudile raziskave alternativnih biopesticidov, ki so varnejši za okolje in ljudi. Ena izmed obetavnih tehnologij je RNA interferenca (RNAi), ki temelji na uporabi dvojno verižne RNA (dsRNA) za specifično zatiranje esencialnih genov pri škodljivcih. Ta pristop se uporablja v dveh glavnih oblikah: kot transgeni pridelki, ki vsebujejo dsRNA, ali kot pršilni biopesticidi. Kljub številnim prednostim, kot so visoka specifičnost in hitra razgradnja v naravi, pa je treba upoštevati tudi tveganje za razvoj odpornosti pri ciljnih žuželkah. Zato so ključnega pomena ustrezne strategije za obvladovanje odpornosti (IRM), ki se razlikujejo glede na način uporabe RNAi.

Splošno o RNAi

Leta 1998 sta dr. Andrew Fire in dr. Craig Mello odkrila RNA interferenca (RNAi) ali post-transkripcijsko utišanje genov pri raziskavah na Caenorhabditis elegans, kjer sta opazila, da dvojnovijačna RNA (dsRNA) povzroči utišanje genov. Za to odkritje sta leta 2006 prejela Nobelovo nagrado. Gre za biološki proces, ki omogoča uravnavanje genske ekspresije z uničenjem specifične mRNA ali zaviranjem njene translacije [2].

Ključni elementi v procesu RNAi je dvojnovijačna RNA (dsRNA). Proces začne encim Dicer, ki razreže dolge verige dsRNA na kratke fragmente imenovane siRNA (small interfering RNA). Te fragmente prevzame RISC kompleks (RNA-induced silencing complex). Znotraj RISC se ena od verig siRNA (nekodirajoča) uporabi za iskanje komplementarne mRNA. Ko RISC najde ciljno mRNA, jo encim Argonaute razreže, kar prepreči prevajanje v protein. siRNA je zelo specifična, saj se veže le na natančno ujemajočo se mRNA [3].

miRNA (microRNA) je endogena oblika RNA, ki nastane v jedru celice iz nekodirajočih regij DNA. Enoverižna RNA (ssRNA) se zaradi komplementarnih zaporedij znotraj molekule samoorganizira v zanko, ki jo encim Drosha obdela v predhodnik miRNA (pre-miRNA). Ta se prenese v citoplazmo, kjer ga encim Dicer razreže v zrelo miRNA. RISC kompleks nato uporabi miRNA za iskanje ciljne mRNA. Za razliko od siRNA se miRNA lahko veže na 3' UTR regijo mRNA in prepreči prevajanje brez razcepa molekule. miRNA je manj specifična – ena miRNA lahko vpliva na več različnih mRNA, kar omogoča sinhrono uravnavanje številnih genov [3].

Uporaba RNAi v agrikulturi

V agrikulturi se za ustvarjanje rastlin, odpornih na škodljivce, uporablja RNAi-tehnologija, pri kateri se v rastline vnaša dsRNA, specifična za esencialne gene insektov. To dosežejo z vektorji, kot je bakterija Agrobacterium tumefaciens, ki prenese dsRNA v genom rastline. Ko škodljivec zaužije tkivo transgene rastline (npr. koruza SmartStax PRO®), encim Dicer v njegovih celicah razreže dsRNA na kratke interferečne RNA (siRNA). Te se vežejo na Argonaut encim v kompleksu RISC, ki identificira in razgradi mRNA s komplementarnim zaporedjem, kar zmanjša proizvodnjo ključnih proteinov in vodi do smrti škodljivca. Ta mehanizem je izjemno specifičen, saj cilja samo žuželke z ustreznim genetskim zaporedjem, ne pa tudi druge organizme [1].

Problematika odpornosti insektov

Žuželke lahko sčasoma razvijejo odpornost na insekticide zaradi nevarnega selekcijskega pritiska. Ob uporabi insekticidov preživijo tiste, ki imajo genetske mutacije. Te jim omogočajo preživetje, prenesejo pa jih na svoje potomce. To vodi v populacijo, kjer prevladujejo odporni osebki. Poleg tega številni insekticidi delujejo na podobne tarče v telesu žuželk, kar pa povzroči navzkrižno odpornost. Gre za pojav, kjer žuželke postanejo odporne na več različnih insekticidov hkrati. Poleg tega imajo kemični insekticidi pogosto tudi negativen vpliv na okolje in druge organizme, zato je iskanje prijaznejših rešitev nujno potrebno. [1]

Kot alternativo kemičnim insekticidom se razvijajo RNAi pesticidi, ki uporabljajo dvovijačno RNA (dsRNA) za specifično utišanje vitalnih genov v žuželkah. Ti pripravki delujejo zelo specifično in imajo manjši vpliv na okolje, saj se dsRNA hitro razgradi in ne vpliva na druge organizme, vključno z ljudmi. Vendar pa obstaja možnost, da žuželke razvijejo odpornost tudi na RNAi tehnologijo, zlasti pri dolgotrajni ali nepravilni uporabi. To tveganje je posebej pomembno pri rastlinah, ki same proizvajajo dsRNA, in pri biopesticidnih pršilih, ki se nanašajo na liste. Zato je ključno, da se strategije za upravljanje odpornosti (IRM) skrbno prilagodijo vsaki posamezni kulturi in načinu uporabe RNAi. [4]

Primeri razvoja odpornosti na dsRNA pri žuželkah

Raziskave so pokazale, da lahko žuželke razvijejo odpornost na dsRNA. Na primer, pri zahodnem koruznem črvu (Western corn rootworm) je po več generacijah izpostavljenosti gensko spremenjeni koruzi, ki izraža dsRNA DvSnf7, opazili več kot 130-kratno odpornost. Podobno je koloradski hrošč (Leptinotarsa decemlineata) po devetih generacijah izpostavljenosti dsRNA pršilu razvil več kot 11.000-kratno odpornost. V obeh primerih je bila odpornost povezana z zmanjšano sposobnostjo privzema dsRNA v črevesne celice. Ne pojavi pa se odpornost proti Bt proteinih (te proteine proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis) in kemičnih sredstvih, ki imajo drug način delovanja. Za učinkovito upravljanje odpornosti (IRM) je mogoče RNAi izdelke pametno kombinirati z drugimi sredstvi. [1]

Mehanizem odpornosti na dsRNA

Učinkovitost RNAi temelji na več zaporednih korakih, da lahko pride do uspešnega utišanja ciljnih genov. Če pride do mutacije v katerem od teh, lahko to privede do odpornosti. Najpogosteje je odpornost povezana z zmanjšanim privzemom dsRNA v celice zaradi motenj v delovanju SID-1 podobnih membranskih proteinov. Lahko pride tudi do mutacij v genih, kot so Dicer ali proteinih, ki sodelujejo v gradnji kompleksa RISC. S tem se prepreči tvorba siRNA in razgradnja tarčne mRNA. Prav tako lahko povečana aktivnost encimov RNAz v črevesju povzroči razgradnjo dsRNA že pred vstopom v celice. V tem primeru govorimo o naravni odpornosti. [5]

Uporaba različnih pristopov dsRNA

V boju proti škodljivcem se uporabljajo transgene rastline, ki proizvajajo dsRNA in pršila z dsRNA. Pri transgenih rastlinah je dsRNA stalno prisotna, kar pomeni konstantno izpostavljenost škodljivce že v rastlini skozi celotno sezono. Insekti so tako konstantno izpostavljeni enakim koncentracijam dsRNA pri enakih poljščinah. V teh primerih je problem, da se lahko razvije odpornost. Temu se izognemo tako, da pri semenih uporabimo 5% teh brez dsRNA. Insekti se v tem delu ne potrebujejo prilagoditi in ne pride do genetskih sprememb. Kljub temu se kot strategija IRM priporoča kombinacija z različnih mehanizmi delovanja. [1]

Pri drugem načinu pa rastlinam dodamo dsRNA s pršenjem. Lahko se uporablja preventivno, da preprečimo razmnoževanje insektov ali kurativno, ko je škodljivec že prisoten. Za razliko od transgenih rastlin je tu dsRNA prisotna samo v krajšem časovnem obdobju. Insekti so izpostavljeni samo za kratek čas. Poznamo različne insekticide, ki delujejo na različne faze v življenjskem ciklu (npr. pri ličinkah). DsRNA se v okolju hitro razgradi zato jo moramo vedno znova rastlinam dodajati. Odpornost lahko zmanjšamo tako, da uporabljamo različna pršila v ustreznih časovnih obdobjih, pomembno pa je natančno uskladiti intervale pršenja. Prav tako je priporočljivo uporabiti pršila z različnim mehanizmom delovanja skozi celotno sezono. [1]

Upravljanje z odpornostjo insektov na dsRNA pesticide

Žuželke, ki v kmetijstvu povzročajo škodo, so izpostavljene selekcijskim pritiskom kot so pesticidi ali kolobarjenje, bodo ob nepravilni rabi teh sredstev nanje razvile odpornost [1, 6]. Razvoj odpornosti ponavadi poveča potrebo po količini pesticidov in bolj strupenih snovi. Ob razvoju odpornosti škodljivca na pesticid se ponavadi tudi poveča škoda na pridelkih [6]. Strategija upravljanja odpornosti insektov na dsRNA pesticide je odvisna od njihovega načina uporabe. Za borbo proti ličinkam koruznega hrošča, ki napadajo korenine koruze, se uporablja gensko spremenjeno koruzo, ki v tkivu izraža ustrezno dsRNA, za zatiranje koloradskega hrošča pa krompirjeve liste popršimo s škropivom, ki vsebuje dsRNA . Vsak od teh pristopov zahteva različne načine preprečevanja odpornosti [1].

Znano je, da so proteini, ki jih izraža t.i. Bt – koruza zelo učinkovito sredstvo za zaščito pred koruznim črvom. Bt – koruza je gensko spremenjena tako, da izraža proteine Cry, ki jih najdemo v Bacillus Thuringensis. Pri preprečevanju razvoja odpornosti na rastline, ki izražajo insekticidno dsRNA, si lahko pomagamo tako, da gensko spremenjena koruza izraža več proteinov Cry ter dsRNA. Ta kombinacija je zelo učinkovita proti ličinkam koruznega hrošča, ne pa tudi proti odraslim hroščem, ki so zmožni zaradi nizkih (nesmrtonosnih) koncentracij dsRNA v tkivih, ki jih jedo (listi), razviti odpornost. Ta lastnost se kasneje prenese na naslednjo generacijo. Odpornim hroščem ta lastnost pomaga, saj selekcijski pritisk odstrani njihove neodporne sovrstnike [1]. Če pa populacija ni odporna na proteine Cry, bo rastlina še vedno zaščitena pred škodljivci. To poudari pomembno lastnost insekticidne dsRNA: navzkrižno odpornost na ostale metode zaščite (ne dsRNA) ob pravilnih kombinacijah povzroči le redko [7]. Poleg zaščite rastlin z dsRNA in proteini Cry pa lahko uporabimo tudi več različnih dsRNA, ki bodo tarčile različne mRNA. Odpornost na takšno zaščito škodljivci razvijejo mnogo težje, uspešno pa so jo uporabili za zaščito bombaža pred parazitskimi glistami Meloidogyne incognita [8]. Pri kultivaciji rastlin, ki vsebujejo “zaščitne” gene je nujna uporaba kmetijskih tehnik kot so kolobarjenje in sajenje nespremenjene koruze med spremenjene primerke (refuge), da preprečimo razvoj odpornosti [1]. Kolobarjenje pomaga pri zatiranju koruznega hrošča, saj zmotimo njegov razvojni cikel. Odporne ličinke koruznega hrošča živijo v prsti in se hranijo izključno z koreninami koruze. Če na polje, kjer so prisotni koruzni hrošči oz. njihova jajčeca, pravočasno posadimo pridelke, ki jih ta škodljivec ne je, bodo ličinke propadle [6]. Mešano sajenje koruze (refuge) zagotavlja, da se ohranja populacija, ki nima razvite odpornosti na prej omenjene metode zaščite. Prisotnost takšne populacije koruznega hrošča deluje kot nekakšen genetski tampon, ki deluje proti homozigotski recesivni odpornosti [1].

Pri zatiranju koloradskega hrošča se uporablja škropivo z dsRNA kot aktivno učinkovino. Uporaba dsRNA je odprla nove možnosti za zatiranje tega škodljivca, ki je sicer znan po svoji odpornost na insekticide. Kljub temu, da insekticidi na osnovi dsRNA niso znani po tem, da povzročajo odpornost na ostale pesticide, bodo pogosto povzročili odpornost na istovrstne pesticide, ki prav tako vsebujejo dsRNA, čeprav ta cilja na popolnoma drugo mRNA. Velika prednost uporabe teh škropiv je možnost kontrole odmerka, ki ga škodljivci prejmejo. V primeru, da neka žuželka je transgeno rastlino, ki izraža dsRNA, bo žuželka potencialno izpostavljena zelo različnim odmerkom, kar lahko pomeni, da zaradi premajhne doze (kronične izpostavljenosti) ne umre ampak razvije odpornost. Pri uporabi pršila pa naenkrat prejme veliko, pogosto smrtno dozo a se kljub temu odpornost lahko razvije. Za preprečevanje nastanka odpornosti je potrebno upoštevati nekaj smernic, če želimo, da ti insekticidi nove generacije ostanejo učinkoviti. Škropljenje je potrebno izvajati z različnimi pesticidi v različnih delih sezone rasti. S tem dosežemo, da je bila vsaka generacija hroščev izpostavljena le enkrat. Pomembno je, da vsakič uporabimo pesticide z drugim mehanizmom delovanja [1].

Zaključek

Pesticidi, ki delujejo na osnovi RNAi so izjemno pomembni za razvoj okolju prijaznega kmetijstva. Insekticidi osnovani na tehnologiji RNAi so zaradi svoje varnosti, specifičnosti in hitre razgradljivosti ena od najbolj obetavnih alternativ klasičnim sredstvom za zatiranje škodljivcev. Kljub mnogim prednostim pa tudi to tehnologijo pesti ena od precej pogostih težav sodobnega kmetijstva – odpornost določenih insektov na izbran pesticid. Iz prakse vemo, da lahko žuželke skozi nekaj generacij razvijejo odpornost na dsRNA insekticide. Takšne prilagoditve na selekcijske pritiske se kažejo kot slabši privzem insekticida in razgradnja učinkovine, ki poteče že v prebavilih. Za preprečevanje razvoja odpornosti in ohranjanja učinkovitosti teh insekticidov je pomembno natančno spremljanje njihove uporabe ter združevanje z drugimi pristopi za zaščito rastlin, kot sta kolobarjenje, mešano sajenje in uporaba drugih metod za zatiranje populacij škodljivih žuželk. Le s premišljenim ravnanjem v kmetijstvu bomo lahko zagotovili ohranjanje učinkovitosti metod za zaščito rastlin, ki temeljijo na RNAi ter dejanskemu zmanjšanju vpliva kmetijstva na okolje.

Viri

• 1. Narva, Kenneth, et al. ‘Insecticide Resistance Management Scenarios Differ for RNA ‐based Sprays and Traits’. Insect Molecular Biology, Feb. 2025, p. imb.12986. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/imb.12986.
• 2. Fire, Andrew, et al. ‘Potent and Specific Genetic Interference by Double-Stranded RNA in Caenorhabditis Elegans’. Nature, vol. 391, no. 6669, 1998, pp. 806–811. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1038/35888.
• 3. National Center for Biotechnology Information (NCBI). ‘RNA Interference (RNAi): Technical Details’. NCBI Probe Database, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrnai/.
• 4. Christiaens, Olivier, et al. ‘Delivery of dsRNA for RNAi in Insects: An Overview of Current Methods and Future Directions’. Frontiers in Plant Science, vol. 12, 2021, p. 673576. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fpls.2021.673576.
• 5. Scott, Jeffrey G., et al. ‘Towards the Elements of Successful Insect RNAi’. Annual Review of Entomology, vol. 68, 2023, pp. 255–272. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1146/annurev-ento-011019-025224.
• 6. Washim, Mir, et al. ‘Pesticide Resistance in Insects: Challenges and Sustainable Solutions for Modern Agriculture’. International Journal of Agriculture and Food Science, vol. 6, no. 2, 2024, pp. 121–27. www.agriculturaljournals.com, https://doi.org/10.33545/2664844X.2024.v6.i2b.215.
• 7. Moar, William, et al. ‘Cry3Bb1-Resistant Western Corn Rootworm, Diabrotica Virgifera Virgifera (LeConte) Does Not Exhibit Cross-Resistance to DvSnf7 dsRNA’. PLOS ONE, edited by Erjun Ling, vol. 12, no. 1, Jan. 2017, p. e0169175. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169175.
• 8. Lisei-de-Sá, Maria E., et al. ‘Pyramiding dsRNAs Increases Phytonematode Tolerance in Cotton Plants’. Planta, vol. 254, no. 6, Dec. 2021, p. 121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1007/s00425-021-03776-0.