RNA kataliza: napredek pri ribocimsko kataliziranem prenosu alkilne skupine

Uvod

RNA kataliza in hipoteza o RNA svetu

RNA molekule, imenovane ribocimi, so encimi sestavljeni iz RNA namesto proteinov. Znani ribocimi v celicah vključujejo nukleolitične ribocime, samoizrezujoče introne, RNaz P (procesira tRNA) in peptidil transferaze v ribosomu. Kataliza z ribocimi je bila odkrita v 80. letih prejšnjega stoletja. Funkcije zgodnjih ribocimov so bile različne: spajanje RNA molekul, procesiranje tRNA molekul, kataliziranje cepitev glede na specifično mesto (tudi obratno ligacijo) RNA. Kasnejša odkritja so pokazala, da so nekatere ključne celične reakcije katalizirane s pomočjo RNA. To je na primer prenos peptidov v ribosomih in spajanje mRNA. Odkritje encimske funkcije RNA je tako dopolnilo teorijo o nastanku življenja.

Molekularna biologija temelji na principih, da nukleinske kisline shranjujejo in prenašajo genetske informacije, medtem ko proteini katalizirajo reakcije, vključno z replikacijo in translacijo. O samem začetku teh funkcij in procesov je težko sklepati, zato je bila predlagana poenostavitev te teorije, imenovana hipoteza o RNA svetu. Ta opušča idejo DNA in proteinov ter se osredotoča na RNA, kateri pripisuje dvojno vlogo (shranjevanje informacij, kataliza reakcij). Predvideva se, da je takšen RNA svet obstajal le kratek čas, saj so celice z RNA metabolizmom relativno hitro prepoznale prednosti uporabe peptidov in proteinov. Ta faza je bila morda ključna in je omogočila začetek celotnega procesa. Da bi lahko popolnoma potrdili to hipotezo primanjkuje neposrednih dokazov, vendar glede na to, da je ribosom še vedno ribocim po vsem tem času (več milijard let), je to najprepričljivejši dokaz.

V nadaljevanju bodo predstavljene nove raziskave in dokazi, ki nakazujejo na to, da je RNA lahko katalizirala presnovne reakcije v prvih celicah. Pozornost pa bo usmerjena na reakcije s prenosom alkilnih skupin.

Reakcije, ki jih ribocimi katalizirajo

Znane reakcije ribocimov

Vsi znani naravni ribocimi izvajajo eno od naslednjih reakcij: prenos peptida ali prenos fosforilne skupine. V prvo skupino spada ribosomska RNA, v drugo pa več vrst ribocimov, katere lahko naprej delimo po tipu, ali po mehanizmu reakcije, ki jo katalizirajo. Prvi tip reakcije je transesterifikacija, ki jo katalizirata samoizrezujoča introna 1 in 2 ter RNA, ki sodelije v spliceosomu. Drugi tip je cepitev na specifičnem mestu, katero katalizirajo nukleolitični ribocimi, na primer ribocim kladivo, twister ribocim, ribocim hepatitisa delta itd. Glede na mehanizem poznamo dve glavni skupini: tisto, ki reakcije katalizira na osnovi kovinskih ionov, in tisto, ki uporablja kislinsko-bazno katalizo. V prvo skupino spadata samoizrezovalna introna tipa 1 in 2 in RNaza P, v drugo pa vsi ostali. Te lahko še naprej delimo po točnem mehanizmu kislinsko-bazne katalize, glede na kateri atomi imajo vlogo kisline oziroma baze. Kislina je pogosto eden od dušikov na adeninu ali citozinu, 2’ hidroksilna skupina na ribozi ali hidratirani kovinski ion, kot bazo pa večina ribocimov uporablja 1. dušik na gvaninu, nekateri pa tudi hidratiran kovinski ion.

Bolj kompleskne reakcije ribocimov

Da že za en tip reakcije ribocimi uporabljajo veliko različnih mehanizmov, kaže na to, da so možne reakcije večih vrst, z večjo kompleksnostjo, kar teorija RNA sveta tudi zahteva. Še posebej pomembne so reakcije, kjer nastanejo nove vezi med dvema ogljikoma (C-C), ogljikom in dušikom (C-N) ter ogljikom in žveplom (C-S). Ribocime, ki katalizirajo takšne reakcije, iščemo z in vitro selekcijskimi metodami, kjer na delno ali celotno naključno določeno RNA zaporedje vežemo en reaktant, drugi reaktant pa na biotin. Če RNA zaporedje reakcijo katalizira, se veriga veže na biotin, kar omogoča njeno izolacijo. To zaporedje lahko uporabimo za naslednji cikel selekcije¹. Na tak način so našli ribocime, ki lahko lahko katalizirajo kompleksne reakcije kot so aldolna adicija, adicija po Michaelu, prenos acilne skupine, Diels-Alder ciklizacija in ostale.

Večina teh ribocimov še nima določene strukture, skoraj noben določenega mehanizma. Od vseh so najbolj opisani tisti, ki katalizirajo premestitve metilnih ali alkilnih skupin, kjer se tvorijo vezi med ogljikovimi in dušikovimi atomi (C-N). Skupine, ki jih te ribocimi lahko prenašajo so raznolike: od enostavne metilne skupine do bolj kompleksnih alkilnih skupin, kot so na primer propargilna skupina, ki se uporablja pri klik kemiji, polietrska veriga z epoksidno skupino in ostale. Donorji skupin so lahko SAM (S-adenozil metionin), ki prispeva metilno skupino, ali spremenjeni nukleotidi za ostale skupine.

Struktura je bila določena večim v tej skupini. Nekateri so zgrajeni iz enostavnih struktur iz lasničnih zank, na primer ribocim SMRZ-1. Ta veže SAM v velikem žlebu, podobno kot pri RNA stikalu SAM-V, in metilira RNA. Glede na strukturo aktivnega mesta lahko sklepamo, da za katalizo poleg orientacije in bližine reaktantov, RNA in kofaktorja, ni potrebna nobena druga skupina. Enako je tudi pri epoksid-vezavnem ribocimu, ki ima podobno strukturo iz lasnične zanke in tudi ne potrebuje drugih skupin za katalizo reakcije. Ker za določitev ribocimov, ki so sami sposobni vezati kofatorje v pravi orientaciji za katalizo reakcije, potrebujemo le nekaj ponovitev selekcije, lahko sklepamo, da se po še večih ponovitvah selekcije lahko razvijejo ribocimi, ki uporabljajo bolj kompleksne mehanizme katalize.

MTR1, ribocim, ki katalizira prenos alkilne skupine

MTR1 je in vitro razvita katalitična RNA, ki veže različne spojine O⁶-alkilgvanina in omogoča prenos alkilne skupine na N1 izbranega adenina v RNA. Podobno funkcijo ima encim za popravljanje DNA (DNA O⁶-metilgvanin transferaza). Izdelavo MTR1 so začeli z oblikovanjem izbočenega trikrakega stičišča, ki je vsebovalo osrednji del s 40 naključnimi nukleotidi. Sledila je inkubacija z biotiniliranim O⁶-benzilgvaninom, pri čemer je bila selekcija usmerjena tako, da se je biotinsko označena alkilna skupina kovalentno vezala na RNA. S pomočjo še dodatnega inženiringa pa so na koncu ustvarili MTR1. Njegova funkcija je katalizacija prenosa alkilne skupine na N1 položaj adeninske nukleobaze v jedru stičišča. Zagotavlja popoln in hiter prenos (1 min⁻¹ v optimalnih pogojih).

Osnovne značilnosti in struktura MTR1

3D struktura je bila določena s kristalografijo. Ta je potrdila, da reakcija poteče do konca. Rezultat reakcije je popoln prenos alkilne skupine z zunanje O⁶-alkilgvaninske spojine na N1 adenina A63 v tarčni verigi. Aktivna struktura je sestavljena iz trikrakega helikalnega stičišča, v katerem se odvijajo vse reakcije. Jedro sestavljajo štiri ravnine baznih interakcij. Ravnino 1 in 2 predstavljata bazna para G:C. Na vrhu je ravnina 4, ki je sestavljena iz trojne interakcije med tremi adeninovimi nukleotidi. Produkt reakcije (eksogeni gvanin) tvori ravnino 3. Gvanin je vezan z vodikovimi vezmi na nukleobaze C10 in U45 ter na N6 tarčnega A63, katere so v isti ravnini. Ta kompleks predstavlja aktivno središče ribocima. Pred reakcijo je eksogeni produkt gvanina prisoten kot O⁶-alkilgvanin, po reakciji pa se stabilizira s sedmimi vodikovimi vezmi: tri vezi z nukleobazo C10, tri z U45 in ena z A63. Poleg tega je umeščen med G:C bazni par na spodnji strani ter trojno interakcijo treh adeninov, ki sestavljajo zgornjo ravnino 4.

Katalitski mehanizem alkiltranferazne aktivnosti MTR1

Struktura ribocima narekuje mehanizem katalize, ki jo omogočajo trije ključni dejavniki. O⁶-alkilgvanin se močno poveže z ribocimom, kar zmanjša aktivacijsko entropijo. Geometrija omogoča poravnavo neveznih elektronov na N1 adenina 63 z vezjo C-O, kar vodi do optimalnega prekrivanja σ* orbital. Struktura ribocima prav tako nakazuje mehanizem, kjer se citozin 10 obnaša kot kislina in protonira O⁶-alkilgvanin. Pri nevtralnem pH je citozin 10 neprotoniran, vendar vezava O⁶-alkilgvanina pri aktivnem MTR1 ribocimu povzroči protonacijo N3 in stabilizacijo preko tvorbe vodikove vezi z N1².

Mehanizem predvideva, da se alkilna skupina prenese na tarčni N1 adenina 63, ponovno vzpostavljena karbonilna dvojna vez na gvaninu (brez alkila) pa ustvari negativni naboj na N1. Citozin 10 s protoniranim N3, ki deluje kot kislina, omogoči nastanek vodikove vezi med N3 in N1 O⁶-alkilgvanina, kar stabilizira protonirano obliko citozina 10 in njegov pKa dvigne na 6,3. Eksperimentalno dokazano se reakcijska hitrost povečuje z nižanjem pH, optimalen pa je pH 6,0. Prenos protona iz N3 na N1 gvanina nevtralizira negativen naboj na N1 in ponovno regenerira citozin na njemu lasten pKa ~3,53.

Predlagan mehanizem je podprt z mutagenetskimi študijami, poskusi so pokazali, da mutacija citozina 10 povzroči skoraj popolno izgubo aktivnosti ribocima. Uporabljeni so bili mutanti citozina s spremenjeno pKa vrednostjo protonskega donorja N3, ki so ohranili Watson-Crickov rob, odgovoren za tvorbo vezi s substratom. 1-Deazacitozin [C(n1c)], kjer zamenjava N1 z ogljikom povzroči pKa 11,4; kar N3 onemogoči kislinsko katalizo, in psevdo izocitozin [C(n1c, c5n)], ki ima zaradi zamenjave C5 z dušikom pKa 3,7 oz. 9,4; kar ponovno vzpostavi za katalizo primerno nizek pKa. Hitrost transferazne aktivnosti ribocima je bila izmerjena z denaturirajočo poliakrilamidno gelsko elektroforezo, kjer so kot substrat k radioaktivno označeni RNA dodali O⁶-(4-aminometil-benzil)-gvanin. RNA z vezanim 4-aminometil-benzilom zaradi povečane mase v gelu potuje počasneje, zato pride do učinkovite separacije, ki omgoča kvantitativno meritev pretvorbe skozi čas³.

Kvantnomehanski izračuni pokažejo, da protonacija in prenos alkilne skupine ne nastopita sočasno, saj bi takšna reakcija zahtevala premostitev visoke energijske bariere. Najprej pride do prenosa protona, ki naredi alkilno skupino bolj elektrofilno, šele nato do prenosa alkilne skupine⁴.

Zaključek

Zaradi ovir, ki jih ribocimu povzroča njegova lastna kemijska sestava, je najverjetneje deloval skupaj s koencimom, saj RNA, kot prikazano pri RNA stikalih, z lahkoto veže majhne ligande². Tudi mnogi moderni koencimi vsebujejo RNA kofaktorje, npr. NAD⁺, FAD, CoA, ATP. Prisotnost RNA v ključnih koencimih nakazuje na možno vlogo RNA v evolucijsko zgodnjih metabolnih procesih, pred začetkom encimske katalize. Obstoj ribocimov, ki lahko katalizirajo širok nabor reakcij ostaja še neodgovorjeno vprašanje, odgovor nanj pa morda skriva povezava z RNA stikali, pri katerih lahko zaradi možnosti vezave ligandov sklepamo na evolucijsko podobnost z ribocimi¹.

Viri

• 1 Wilson TJ, Lilley DMJ. The potential versatility of RNA catalysis. WIREs RNA 2021; 12: e1651.
• 2 Lilley DMJ, Huang L. RNA catalysis moving towards metabolic reactions: progress with ribozyme catalyzed alkyl transfer. Trends in Biochemical Sciences 2025; : S096800042500026X.
• 3 Wilson TJ, McCarthy E, Ekesan Ş, et al. The Role of General Acid Catalysis in the Mechanism of an Alkyl Transferase Ribozyme. ACS Catal 2024; 14: 15294–305.
• 4 McCarthy E, Ekesan Ş, Giese TJ, et al. Catalytic mechanism and pH dependence of a methyltransferase ribozyme (MTR1) from computational enzymology. Nucleic Acids Research 2023; 51: 4508–18.