RNA vezavni proteini

Uvod

RNA-vezavni proteini (RBP) predstavljajo ključno skupino regulatornih molekul, ki sodelujejo v skoraj vseh vidikih presnove RNA. Sodelujejo pri transportu, stabilizaciji in translaciji različnih RNA molekul. Z različnimi domenami se lahko vežejo na RNA, ponavadi pa se povezujejo tudi z drugimi proteini v kompleksne ribonukleinske delce (RNP) za opravljanje bolj zapletenih nalog. V delovanje RBP-jev smo se poglobili na primerih popravljanja DNA, nadzora RNA in ohranjanja telomer. Njihov vpliv na patofiziologijo in njihov potencial kot terapevtske tarče pa smo predstavili na primerih nevrodegenerativne bolezni ALS in na primeru raka.

Struktura in funkcija

Ena izmed najbolj značilnih lastnosti RBP je izrazita strukturna raznolikost, ki odraža širok spekter vlog. RBP ločujemo glede na prisotnost RNA vezavne domene, vlogo intrinzično neurejenih regij, ter specifičnost sekvence in strukturnih motivov ki omogočajo vezavo na RNA. Ločimo štiri različne RNA vezavne domene, in sicer RNA prepoznavni motiv (RRM), homologijo K (KH), vezavni motiv za dvovijačno RNA (dsRBM) in domeno cinkovega prsta (ZnF). Pomembno vlogo igrajo tudi specifični sekvenčni in strukturni motivi, ki določajo afiniteto in specifičnost vezave na ciljno RNA. Razumevanje teh strukturnih značilnosti je ključno za pojasnjevanje, kako RBP usmerjajo zapletene procese uravnavanja izražanja genov na ravni RNA.

RRM (angl. RNA recognition motif) je najpogostejša domena RBD, ki omogoča vezavo proteinov na RNA v evkariontskih organizmih. Zapisi za RRM domeno obsegajo približno 0,5-1% človeškega genoma, kar poudarja njen izreden pomen.RRM je sestavljen iz približno 90 aminokislin in ima zgradbo β1α1β2β3α2β4 , pri čemer štiri β-verige tvorijo antiparalelen β-, obdan z dvema α-vijačnicama.RRM vsebuje dve ohranjeni zaporedji, RNP1 in RNP2. Prvo sestavlja osem, drugo pa šest aminokislinskih ostankov. Zaporedji se nahajata na β1 in β3 trakovih, ki se nahajata v središču domene. Na RNP1 in RNP2 so trije aromatični aminokislinski ostanki, ki tvorijo vezavno mesto za RNA. Glede na prisotnost teh aminokislinskih ostankov ločimo podvrste RRM, na primer kvazi-RRM (qRRM), psevdo-RRM (Ψ-RRM) in U2AF homologni motivi. Pomemben del funkcionalnosti RRM je tudi njihova zmožnost tvorjenja kompleksnejših interakcij z RNA, zaradi prisotnosti večjega števila RRM na enem proteinu. Eden takih je protein FUS, ki zaradi več prisotnih RRM lahko veže oddaljene RNA elemente. Večje število RRM motivov tako privede do večje selektivnosti in afinitete [1].

Druga pomembna domena je domena cinkovega prsta (ZnF), ki je ponavadi dolga 30 aminokislinskih ostankov in tvori sekundarno strukturo ββα. α vijačnica in zanka, ki povezuje β ploskvi, tvorita vezavno mesto za Zn2+. Vezavno mesto je sestavljeno iz štirih aminokislinskih ostankov, ki so lahko cisteini in histidini (C2H2, CCCH) , ali pa samo cisteini(CCCC). ZnF domene se lahko vežejo na ogrodje RNA, ali pa tvorijo specifične vezave z organskimi bazami [2].

Domeno KH delimo na dva tipa. Oba tipa sta dolga približno 70 AK. Domena KH prvega tipa imajo topologijo βααββα, domene KH drugega, pa topologijo αββααβ.

dsRBM je poseben zaradi načina, na katerega prepozna RNA. Druge vezavne domene RNA prepoznajo po zaporedju, dsRBM pa RNA prepozna po značilni dvovijačni obliki. Prepoznavanje dsRNA je torej pretežno odvisno od oblike, verjetno pa so dsRBM zmožni tudi prepoznave zaporedja.

Štiri predstavljene domene imajo določeno strukturo, ki omogoča njihovo delovanje, vendar so proteini RBP sestavljeni tudi iz drugih domen. Intrinzično neurejene regije (IDR) so deli RBP, ki zaradi svoje neurejenosti omogočajo fleksibilnost proteina, ter s tem zmožnost vezave na različna RNA vezavna mesta. Zanje je značilno, da v običajnih fizioloških pogojih nimajo stabilne strukture. Poleg tega lahko delujejo tudi kot regije, na katerih poteče sprememba konformacije [3].

Vloga RBP v celici je velika. Naloge RBP zajemajo različna področja, od samega začetka prepisovanja in izrezovanja genov, do regulacije stabilnosti mRNA in razgradnje. Ne vplivajo samo na mRNA, vendar tudi na nekodirajočo RNA.

Ohranjanje genomske stabilnosti

Ohranjanje stabilnosti genoma je sposobnost celice, da ohrani genomsko zaporedje med podvajanjem in celičnim stresom. RBP-ji imajo pri tem pomembno vlogo.

Odziv na poškodbe DNA

Do poškodb na DNA pride zaradi endogenih (reaktivne kisikove zvrsti) ali eksogenih (UV, ionizirajoče sevanje, kemikalije) dejavnikov, lahko pa tudi načrtovano pri nekaterih bioloških procesih (mejoza, diverzifikacija protiteles). V vsakem primeru gre za proces, ki potrebuje učinkovit popravljalni mehanizem. Zaščito genoma pred poškodbami zagotavlja t. i. odziv na poškodbe DNA (angl. DNA damage response - DDR) - skupek procesov, sproženih po zaznavi poškodovanega mesta, ki učinkujejo tako, da ustavijo celični cikel, popravijo poškodbo ali sprožijo apoptozo [4]. Včasih so mislili, da RBP-ji sodelujejo pri popravljanju poškodb na DNA zgolj posredno preko post-transkripcijske regulacije izražanja genov (alternativno izrezovanje, stabilizacija mRNA, ki zapisuje za proteine, udeležene v DDR). Raziskave pa so pokazale, da najdemo RBP-je tudi na mestu poškodbe [5]. Eden glavnih RBP-jev, ki so poleg svoje funkcije pri metabolizmu RNA vključeni tudi v DDR, je FUS. Vendar kako ti proteini pridejo na poškodovano mesto? Poškodbe na DNA zaznava poli(ADP-riboza) polimeraza 1 (PARP1). Ko pride do poškodovanega mesta, se aktivira njena ADP-ribozilacijska aktivnost. Na tarčne proteine in sama nase začne dodajati ADP-riboze, da natanejo polimeri ADP-riboz (PAR). Ti imajo podobne strukturne lastnosti kot RNA (negativni naboj, struktura). RNA-vezavni proteini kot je FUS lahko interagirajo z nastalimi PAR in tako pridejo na mesto poškodbe, ko je to potrebno. Kakšno vlogo ima prisotnost FUS na mestu poškodbe še ni jasno. Ena od verjetnih razlag je, da se s tem poveča kapaciteta tega območja, da veže nase še vse ostale proteine, potrebne za odpravo poškodb [5].

Nadzor RNA

RBP-ji zagotavljajo pravilno izražanje genov tudi preko nadzorovanja RNA. Ti mehanizmi so namenjeni zaznavi nepravilnosti v molekulah RNA in odstranitvi napačnih transkriptov, s čimer preprečijo sintezo nedelujočih proteinov. Pri evkariontih so znani trije glavni načini nadzora mRNA: razgradnja zaradi nepomenske mutacije, razgradnja zaradi zastoja ribosoma in razgradnja zaradi manjkajočega stop kodona. Razgradnja zaradi nepomenske mutacije (angl. nonsense-mediated decay - NMD) je odgovorna za prepoznavanje in razgradnjo mRNA, ki vsebujejo predčasni stop kodon. Razgradnja tovrstnih mRNA je pomembna, saj bi sicer nastali prekratki proteini, ki v celici povzročajo težave. Glavni RBP, vključen v to pot je UPF1, od ATP odvisna RNA helikaza. Razvija mRNA in prepoznava mRNA s predčasnim stop kodonom ter jih pošlje v razgradnjo. Danes vemo, da je NMD pomembna tudi pri uravnavanju količine povsem pravilnih mRNA, kot prilagoditev na potrebe celice [6]. Zato so pomembne tudi interakcije UPF1 z drugimi RBP-ji, ki zaščitijo mRNA pred razgradnjo tako, da preprečijo vezavo UPF1. Razgradnja zaradi zastoja ribosoma (angl. no-go decay - NGD) je odziv na zastajanje ribosomov, do česar pride zaradi zvijanja mRNA v sekundarne strukture, redkih kodonov ali prezgodnjih stop kodonov. Zastale ribosome prepoznata RBP Dom34 in Hbs1 in sprožita njihov razpad ter razgradnjo mRNA z eksosomskim kompleksom. Ta pot je pomembna tudi zato, ker omogoča recikliranje ribosomskih podenot. Razgradnja zaradi manjkajočega stop kodona (angl. non-stop decay - NSD) povzroči uničenje mRNA in proteinov, če na na mRNA ni stop kodona. Pri translaciji poli-A repa nastane pozitivno nabita veriga lizinov, ki interagira z negativno nabito ribosomsko RNA, kar povzroči zastajanje ribosoma. Pride do zaznave zastalih ribosomov in razgradnje transkripta [7].

Ohranjanje dolžine telomer

Regulacija dolžine telomer je kompleksna. Del te regulacije je tudi TERRA (angl. telomeric-repeat-containing RNA) - RNA, ki se prepiše iz telomernih regij in RNA-vezavni protein, imenovan hnRNP A1 (heterogen jederni ribonukleoprotein A1). TERRA sama deluje kot inhibitor telomerazne aktivnosti, saj se pari s telomerazno RNA, ki služi kot matrica za sintezo telomer. Vendar se in vivo ta inhibicija lahko zmanjša tako, da se na TERRA veže hnRNP A1. Poudariti je potrebno, da mora biti tega proteina ravno prav, saj pri prekomernem izražanju tudi ta deluje kot inhibitor telomerazne aktivnosti [8]. TERRA je nagnjena k tvorbi RNA:DNA hibridov na telomernih regijah, zaradi česar nastanejo t. i. R-zanke, ki lahko predstavljajo oviro pri replikaciji. RBP NONO in SFPQ se lahko vežeta na TERRA in tako zmanjšata nastajanje nevarnih RNA:DNA hibridov [9].

Bolezni

RBP-ji so torej pomembni za pravilno delovanje celice. V primeru nepravilnega delovanja lahko pride do vrste bolezni, od nevrodegenerativnih do raka, srčno-žilnih in drugih.

ALS

RBPji so pomembni na primer pri amiotrofični lateralni sklerozi (ALS). To je nevrodegenerativna bolezen za katero je značilna postopna izguba mišične moči, ki vodi do težav z govorom, požiranjem, gibanjem udov in dihanjem. RBP-ja FUS in TDP-43 fiziološko delujeta v jedru in sodelujeta pri metabolizmu RNA. Pri ALS in drugih boleznih agregirata v citoplazmi, ti veliki agregati pa so toksični. V citoplazmi motijo normalno delovanje celice, na primer transport snovi skozi jedrno ovojnico in RNA metabolizem. Lahko povzročijo tudi celično smrt. Odmiranje mišičnih nevronov pa je prav razlog za ALS. Kopičenje teh agregatov je eden izmed znakov bolezni na molekularni ravni, je pa tudi zanesljiv pokazatelj resnosti in napovedni dejavnik nadaljnjega poteka bolezni. Agregati FUS in TDP-43 so potencialna tarča za zdravljenje ALS. Raziskuje se različne možnosti. Ena od možnosti je tarčenje gena C9orf72, ker v okvarjeni različici sodeluje pri agregaciji proteina. S CRISPR Cas9 tehnologijo se gen lahko popravi, s protismerno RNA pa se lahko inhibira njegovo izražanje. Raziskuje se tudi tarčenje samih agregatov. Z majhnimi molekulami se da stabilizirati RBP, da ti ne agregirajo. Če se v celici poveča raven autofagije, se takih agregatov lahko znebi sama.

Rak

RBP-ji so različni proteini z različnimi funkcijami, zato ni presenetljivo, da včasih delujejo en drugemu navzkriž. Pri rakastih obolenjih je to posebej očitno - nekateri RBP-ji nastanek raka spodbujajo, drugi pa to preprečujejo. Proteini HuR stabilizrajo mRNA za onkogene, CELF2 pa s stabilizacijo določenih mRNA preprečujejo napredovanje raka. Zdravljenje raka prek manipulacije RBP-jev se osredotoča predvsem na inhibicijo onkogenih aktivnosti RBPjev. Direktno in specifično tarčenje RBP-jev je bilo dolgo časa relativno težavno, nova metoda RNA-PROTAC pa obljublja boljše rezultate. Ideja je, da z združitvijo RNA in majhnih molekul, ki nase vežejo ubikvitin ligazo, lahko specifično ubikvitiniramo določene RBP-je. Za njihovo razgradnjo pa se sistem opira na celicam lastne proteasome.

Zaključek

Opisali smo strukturo RBP-jev - te proteine sestavljajo različne RNA vezavne domene in druge domene, pomembne za njihovo funkcijo. Potem smo opisali vpliv RBP-jev na stabilnost genoma - kje in kako sodeluje pri popravljanju DNA, kako sodeluje pri vzdrževanju telomer ter kako RBPji sodelujejo v regulaciji prepisa mRNA. Za konec smo si pogledali še njihovo vlogo pri dveh primerih bolezni, ki sta povezani z RBP-ji, ter na hitro omenili še druge načine zdravljenja obolenj, povezanih z RBP-ji. V članku so poudarili še, da je področje relativno slabo raziskano in da bomo z boljšim razumevanjem delovanja RBPjev lahko odkrili nove pristope k zdravljenju v sodobni medicini.

Viri

• A. T. Aborode, O. A. Abass, S. Nasiru, M. U. Eigbobo, S. Nefishatu, A. Idowu, Z. Tiamiyu, A. A. Awaji, N. Idowu, B. R. Busayo, idr.: RNA binding proteins (RBPs) on genetic stability and diseases. Glob. Med. Genet. 2025, 12, 100032. DOI: 10.1016/j.gmg.2024.100032

[1] C. Maris, C. Dominguez, F. H. ‐T. Allain: The RNA recognition motif, a plastic RNA‐binding platform to regulate post‐transcriptional gene expression. FEBS J. 2005, 272, 2118–2131. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2005.04653.x

[2] S. A. Wolfe, L. Nekludova, C. O. Pabo: DNA Recognition by Cys2 His2 Zinc Finger Proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000, 29, 183–212. DOI: 10.1146/annurev.biophys.29.1.183

[3] D. S. M. Ottoz, L. E. Berchowitz: The role of disorder in RNA binding affinity and specificity. Open Biol. 2020, 10, 200328. DOI: 10.1098/rsob.200328

[4] B. Mikolaskova, M. Jurcik, I. Cipakova, M. Kretova, M. Chovanec, L. Cipak: Maintenance of genome stability: the unifying role of interconnections between the DNA damage response and RNA-processing pathways. Curr. Genet. 2018, 64, 971–983. DOI: 10.1007/s00294-018-0819-7

[5] M. V. Sukhanova, A. S. Singatulina, D. Pastré, O. I. Lavrik: Fused in Sarcoma (FUS) in DNA Repair: Tango with Poly(ADP-ribose) Polymerase 1 and Compartmentalisation of Damaged DNA. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7020. DOI: 10.3390/ijms21197020

[6] T. Kurosaki, M. W. Popp, L. E. Maquat: Quality and quantity control of gene expression by nonsense-mediated mRNA decay. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019, 20, 406–420. DOI: 10.1038/s41580-019-0126-2

[7] A. L. Karamyshev, Z. N. Karamysheva: Lost in Translation: Ribosome-Associated mRNA and Protein Quality Controls. Front. Genet. 2018, 9, 431. DOI: 10.3389/fgene.2018.00431

[8] S. Redon, I. Zemp, J. Lingner: A three-state model for the regulation of telomerase by TERRA and hnRNPA1. Nucleic Acids Res. 2013, 41, 9117–9128. DOI: 10.1093/nar/gkt695

[9] E. Petti, V. Buemi, A. Zappone, O. Schillaci, P. V. Broccia, R. Dinami, S. Matteoni, R. Benetti, S. Schoeftner: SFPQ and NONO suppress RNA:DNA-hybrid-related telomere instability. Nat. Commun. 2019, 10, 1001. DOI: 10.1038/s41467-019-08863-1