Regulacija transkripcije pri arhejah

Uvod

Regulacija transkripcije je eden izmed ključnih procesov za regulacijo prisotnosti proteinov v celici, kar je zelo pomembno za uravnavanje metabolnih in ostalih procesov. Regulacija poteka v vseh treh stopnjah transkripcije: iniciaciji, elongaciji in terminaciji, ter na stopnji organizacje kromatina.

Regulacija iniciacije

Na iniciacijo transkripcije DNA pri arhejah imajo močan regulatorni vpliv elementi DNA in transkripcijski faktorji.

Regulacija s transkripcijskimi faktorji

Temeljna transkripcijska faktorja sta TATA-vezavni protein (angl. TATA-binding protein, v nadaljevanju TBP) in transkripcijski faktor B (v nadaljevanju TFB). Le-ta sta potrebna za transkripcijo pri optimiziranih pogojih, medtem ko v manj ugodnih pogojih pri začetku transkripcije pomaga transkripcijski faktor E (v nadaljevanju TFE). Za razliko od transkripcije pri evkariontih je odpiranje arhejskega promotorja proces, ki ni odvisen od energije. Zaradi tega sta TBP in TFB sama dovolj za pomoč RNA-polimerazi pri tvorbi prepisovalnega mehurčka. TFB je pri vseh arhejah odgovoren za stabilizacijo kompleksa DNA z vezanim TBP-jem. Skupaj nato novačita RNA-polimerazo. TFE𝛼 vsebuje dve domeni: domena s krilatim heliksom (angl. winged helix, v nadaljevanju WH) in domeno s cinkovim trakom [1]. Domena s krilatim heliksom je ena izmed osrednjih komponent transkripcijskega sistema. Sodeluje pri vzpostavitvi interakcij protein-DNA in protein-protein [2]. TFE𝛽 vsebuje ohranjeni domeni WH in FeS. Domena WH TFE𝛼 tvori kontakt z navzgornjo nematrično verigo DNA in pomaga tvoriti odprti promotorski kompleks. TFE ima morda ključno vlogo pri prilagajanju znotraj-molekulskih premikov RNA-polimeraze skozi transkripcijo, zlasti premik vponke. Interakcija TFE𝛼 z domenama peclja in vponke RNA-polimeraze med iniciacijo transkripcije lahko ohranja vponko v odprti konformaciji, ki je potrebna za iniciacijo in začetek elongacije.

Regulacija z elementi DNA

Uravnavanje prepisovanja elementi DNA vršijo tako, da jih temelnji transkripcijski faktorji prepoznajo in vplivajo na nadaljne korake začetka prepisovanja promotorja. Ločimo štiri elemente DNA, ki uravnavajo začetek transkripcije pri arhejah. To so TATA škatla, ki se nahaja približno 25 bp navzgor od začetka iniciacije transkripcije, BRE - element, ki ga TFB prepozna [1] in določi smer poteka transkripcije [3], lociran tik nad TATA škatlo, INR - iniciacijski element, ki se nahaja v začetni že prepisani regiji, in PPE - element blizu promotorja, ki se nahaja med TATA škatlo in mestom iniciacije transkripcije Encim potrebuje le BRE in TATA škatlo za začetek prepisovanja, čeprav spremembe na ostalih elementih prav tako vplivajo na donos promotorja [1]. Le ta sekvenčna elementa sta pomembna za prepoznavo promotorja [3].

Potek regulacije iniciacije

Sodelovanje naštetih regulatorjev je naslednje. TBP-ji olajšajo prepoznavo AT-bogate regije TATA škatle, ki se nahaja navzgor od mesta začetka transkripcije. To mesto je v arhejah specifično in se tako razlikuje od bolj spremenljivega mesta pri evkariontih. BRE novači TFB, kar omogoča zvitje DNA. Skupaj tako tvorijo orientirano in stabilno konformacijo za interakcijo z arhejsko RNA-polimerazo, kar omogoča nalaganje in razvitje dsDNA. V kolikor so pogoji suboptimalni, pa TFE olajša tvorbo odprtega kompleksa. INR in PPE nista potrebna za iniciacijo, vendar oba ojačata donos transkripcije in njune spremembe povzročijo zmanjšanje moči promotorja [3]. PPE poveča transkripcijski donos preko novačenja TFB-jev. PPE se nahaja na meji transkripcijskega mehurčka, kjer je pomemben za aktivnost TFE𝛼 in TFE𝛽.

Regulatorni učinek nukleosomov

Na začetek iniciacije ima prav tako vpliv struktura kromatina na promotorskem mestu. Lahko omeji ali prepreči iniciacijo transkripcije s tem, da prepreči vezavo transkripcijskih faktorjev ali prepreči denaturacijo DNA. Vezavo omejujejo sterični in torzijski učinki, ki jih povzročajo histoni [1].

Regulacija elongacije

Ko se iniciacija zaključi in elongacije prične, se RNA-polimeraza (v nadaljevanju RNAP) konformacijsko spremeni, pride tudi do izmenjave regulatornih faktorjev. Najverjetnejša razlaga za ta pojav je pojav nascentnega prepisa, ki vpliva na vzpostavitev stabilnega elongacijskega kompleksa. Samih poznanih elongacijskih faktorjev je doslej zelo malo, odkrita sta bila samo dva. Prvi izmed njiju je faktor Spt5, ki je univerzalno ohranjen, najpogosteje ga najdemo v kompleksu s Spt4, odgovornim za stabilizacijo Spt5-RNAP interakcij. Drug je transkripcijski faktor S (TFS), ki kaže homolognost s C-končno domeno evkariontskega TFIIS in funkcijsko analognost GreA/GreB v bakterijah. GreA in GreB sta cepitvena faktorja, ključna za cepitev tri do devet nukleotidov nascentnega prepisa na 3’ koncu [5]. S tem omogočata nadaljevanje elongacije s cepljenega konca. Glede na veliko količino deljenih mehanizmov med evkarionti in arhejami je zelo nenavadno, da slednje v genomu ne vsebujejo kakršnihkoli kompleksov za posttranslacijske modifikacije transkripcijskega kompleksa ali za modifikacije kromatina. Prepisi tudi niso zaščiteni na koncih, ne potrebujejo izvenjedrnega transporta in so brez intronov.

Spt5

Prej omenjen Spt5 je homolog bakterijskemu NusG, sestavljata ga dve domeni. NusG N-končna domena (NGN), ki interagira s Spt4 in vsebuje hidrofobno depresijo, s katero interagira vponka na RNAP, in C-končna Kyepides-Ouzonis-Woese (KOW) domena, katera se za razliko od evkariontov pri arhejah ponovi le enkrat. Slednja ima visoko afiniteto za enoverižno RNA. Interakcije med Spt5 in RNAP niso nujne za elongacijo, a jo vseeno močno ojačajo, specifično z vplivom na procesivnost in hitrost elongacije. Razlog za vpliv leži v stabilizaciji vponske domene, ki dalje stabilizira DNA-RNA hibrid med transkripcijo. NGN ima prav tako stik z že prebranimi aminokislinskimi ostanki, kar onemogoča potovanje RNAP v obratni smeri. Spt5 lahko ima tako pozitiven kot negativen vpliv na hitrost elongacije, lahko jo tudi začasno prekine, glede na potrebe organizma. Za razliko od NGN KOW domena nima znanih partnerjev za interakcije ob sami RNA. Možna neodkrita vloga leži v interakcijah s terminacijskimi faktorji, na kar nakazuje NusG-KOW domena pri bakterijah.

Domene RNAP

Strukturo RNAP lahko opišemo s tremi glavnimi domenami: jedro, vponka in pecelj. Najzanimivejša od teh je domena peclja, ki je ne najdemo pri bakterijski RNAP. Najverjetnejša razlaga za njeno funkcijo je vezava raznih transkripcijskih faktorjev na RNAP za regulacijo njene aktivnosti. Vezava omenjenih faktorjev je ključna za sprožitev intramolekularnih gibanj encima, nujnih za prehod med raznimi fazami transkripcije. Prvi opisi domene so predvidevali, da bo domena peclja močno sterično ovirala vponsko, vendar kristalografska analiza potrjuje, da zaradi koordiniranega gibanja vponke in peclja temu ni tako. Pomembna je tudi funkcija vponke, ki s svojim gibanjem med iniciacijo odpre glavni kanal RNAP, kar olajša vhod in izhod dvoverižne DNA, z zaprtjem pa prepreči pobeg DNA-RNA hibrida. Na konformacijo vplivajo transkripcijski faktorji. Prej omenjen TFE vstopi v stik z obema domenama in vponko pričvrsti v odprt položaj, kar je ključno za iniciacijo, nato tekom elongacije iz encima privre RNA, ki interagira z domeno peclja in sterično trči s TFE, kar vodi do njegove disociacije. Potek dogodkov omogoči vezavo Spt5, ki pomaga encimu vzdrževati zaprto konformacijo in s tem zagotavlja procesivnost med elongacijo.

Regulacije terminacije

Terminacija transkripcije poteče, ko elongacijski kompleks postane dovolj nestabilen, da ne more več vzdrževati stikov med RNA-polimerazo in nukleinskimi kislinami. Stabilnost kompleksa je odvisna predvsem od kontaktov med RNA-polimerazo in ssRNA, navzdoljno DNA in RNA-DNA hibridom ter od njegovih baznih parov. Najverjetneje se med terminacijo spremenijo kontakti med RNA-polimerazo in hibridom ter med baznimi pari v hibridu. Tako kot v drugih domenah, sta tudi pri arhejah predvidena dva mehanizma terminacije. To sta intrinzična in od faktorjev odvisna terminacija.

Razlog za intrinzičen mehanizem so predvsem šibki kontakti med baznimi pari v RNA-DNA hibridu, kar pomeni, da ta mehanizem ni odvisen od aktivnosti nikakršnih transkripcijskih faktorjev. Arhejska RNA-polimeraza se odziva na določena zaporedja zelo podobno kot evkariontska RNA-polimeraza III. Terminacijo sproži pet do deset timidinskih ostankov na nematrični verigi, ki kodira zaporedje poliU na 3' koncu nascentne RNA. To povzroči nastanek rU:dA hibrida (na RNA je veliko uridinov, na DNA pa veliko adeninov) blizu mesta terminacije. Takšen hibrid ni dovolj energetsko stabilen, da bi elongacijski kompleks lahko nadaljeval s transkripcijo, zato ta spontano oddisociira.

V našem članku je od faktorjev odvisna terminacija predstavljena kot zelo verjetna, vendar še ne dokazana. Da bi jo dokazali, so z biokemijskimi analizami našli nekaj potencialnih genov, vendar niso uspeli najti nobenih homologov evkariontskih ali bakterijskih terminacijskih faktorjev. Kljub temu so v arhejah opazili aktivnost, ki bi jo lahko pripisali terminacijskim faktorjem. Gre za polarno represijo navzdoljnih genov brez nadaljnje translacije, kar spominja na delovanje proteina Rho (bakterijski terminacijski faktor). Študije so tudi pokazale, da protein Rho lahko sproži terminacijo pri arhejah in vitro. Dokazali so tudi, da arhejska RNA-polimeraza lahko ustavi sintezo na kraju DNA poškodb in vitro, kar kaže, da tudi pri arhejah obstajajo mehanizmi za odstranitev RNA-polimeraze v primeru poškodb, kar je podpiralo hipotezo, da so tudi v arhejah prisotni terminacijski faktorji. Kasnejše raziskave so uspele ta mehanizem tudi dokazati.

Vpliv razporeditve kromatina

Arhejski histoni zvijajo kromatin na podoben način kot evkariontski. So homo ali hetero tetrameri, homologni H3/H4 evkariontskemu tetrameru. Največja razlika je, da nimajo histonskih repkov. Kondenzacija kromatina omogoča dodatno regulacijo transkripcije preko dostopnosti promotorskih regij in možnih kromatinskih ovir za elongacijski kompleks. Histoni se načeloma ne nahajajo ob promotorskih regijah. Izkazalo se je, da arhejski nukleosomi le upočasnjujejo elongacijo, a je ne preprečujejo. Pri arhejah še niso znane histonske modifikacije ali mehanizmi premikanja nukleosomov, zato sklepajo, da gre elongacijski kompleks preprosto preko nukleosomov, kromatin pa se nato spontano reorganizira v začetno konformacijo. Opazili so tudi, da nukleosomov ni ob mestih terminacije, kar nakazuje, da razporeditev kromatina vpliva tudi na terminacijo transkripcije.

Nekatere študije so pokazale, da imajo pri haloarhejah histoni pomembnejšo vlogo pri regulaciji ekspresije in obliki celice kot pa pri samem kompaktiranju DNA. Tako histonski proteini delujejo kot mestno specifični transkripcijski faktorji. Z delecijo genov za histon so pokazali, da histoni niso nujni in morda celo sploh ne sodelujejo pri organizaciji DNA, kar je v nasprotju z dosedanjimi prepričanji. Še vedno pa ni znano, ali so spremembe v ekspresiji genov, ki so nastale po deleciji, direktna posledica drugačne organizacije genoma ali lokaliziranih motenj, ki so vplivale na regulacijo.

Zaključek

Regulacija transkripcije je tako kot pri drugih organizmih tudi pri arhejah kompleksen in večstopenjski proces, pri katerem je udeleženo mnogo faktorjev in elementov. Do določene mere se lahko primerja z regulacijo pri bakterijah in evkariontih, vendar so pri arhejah prisotne določene posebnosti, značilne le zanje. Je pa v primerjavi z regulacijo pri bakterijah in evkariontih še relativno neraziskana, vendar so znanstveniki na dobri poti k novim odkritjem.

Viri

[1] Gehring, A. M., Walker, J. E., & Santangelo, T. J. (2016). Transcription regulation in archaea. Journal of Bacteriology, 198(14), 1906–1917. https://doi.org/10.1128/JB.00255-16

[2] Teichmann, M., Dumay-Odelot, H., & Fribourg, S. (2012). Structural and functional aspects of winged-helix domains at the core of transcription initiation complexes. Transcription, 3(1), 2–7. https://doi.org/10.4161/trns.3.1.18917

[3]Wenck, B. R., & Santangelo, T. J. (n.d.). Archaeal transcription. Transcription, 11(5), 199–210. https://doi.org/10.1080/21541264.2020.1838865

[4]Dulmage, K. A., Todor, H., & Schmid, A. K. (2015). Growth-phase-specific modulation of cell morphology and gene expression by an archaeal histone protein. MBio, 6(5), e00649-00615. https://doi.org/10.1128/mBio.00649-15

[5] Erie, D. A., Hajiseyedjavadi, O., Young, M. C., & Von Hippel, P. H. (1993). Multiple rna polymerase conformations and grea: Control of the fidelity of transcription. Science, 262(5135), 867–873. https://doi.org/10.1126/science.8235608