Regulation of flowering time in Arabidopsis thaliana

UVOD

Cvetenje (angl. ‘flowering’) je kompleksno uravnan rastlinski proces, ki se prične kot odgovor na različne okoljske in endogene dejavnike. Znanstveniki so z genetskimi študijami določili štiri glavne skupine, ki kontrolirajo proces cvetenja: vernalizacijska pot, fotoperiodična pot, avtonomna in giberelinska pot. Znanstveniki so identificirali veliko genov, ki regulirajo čas cvetenja (angl. ‘flowering time’) v Arabidopsis thailana in se medsebojno povezujejo. Mutacije v tovrstnih genih se fenotipsko odražajo v zakasnitvi cvetenja. V mnogih vrstah rastlin je za to potreben prehod iz juvenilne v odraslo fazo, ki pa je reguliran preko avtonomne poti. Namen raziskave je bila določitev pomembnosti dveh transkripcijskih faktorjev (TF), atVOZ1 in atVOZ2 pri razvoju in cvetenju rastline Arabidopsis thailana.

METODE IN REZULTATI

V raziskavi so uporabili rastlino A. thaliana in mutantne linije znotraj enakega ekotipa. Poskuse so delali na dveh enojnih mutantah (atVOZ1-1 in atVOZ2-1), na dvojni mutanti (atVOZ1-1 atVOZ2-1) in na dvojni mutanti, ki je bila komplementirana z atVOZ2 (atVOZ2; atVOZ1-1 atVOZ2-1) ter jih primerjali z divjim tipom. . V začetnih eksperimentih so opazovali fenotip vseh mutantov ter jih primerjali z divjim sevom. Merili so čas cvetenja, ki je predstavljal čas od dneva saditve do prvega cveta in število rozetnih lističev. Čas cvetenja dvojnih mutant je daljši kot pri divjem sevu, medtem ko v primeru enojnih mutant velikega odstopanja od divjega seva ni bilo, a je bilo še vedno statistično signifikantno. Število rozetnih lističev je bilo pri dvojnih mutantah v DD več kot pri divjem sevu. Naslednja stopnja poskusa je bila potrditev rezultatov, pridobljenih z opazovanjem fenotipa, na molekularni ravni, z različnimi molekularnimi tehnikami. Z metodo RT-PCR so analizirali ekspresijo genov v vseh mutantah in jih primerjali z divjim tipom, ki so bili že iz prejšnjih raziskav znani, da regulirajo proces cvetenja. Flowering locus C (FLC) je gen, ki kodira protein s funkcijo represije cvetenja in le-ta je bil nadizražen v dvojnih mutantah in prav tako velja za preostale preiskovane regulatorje FLC-ja. Gena FD in FT kodirata proteina, ki promovirata cvetenje. V dvojnih mutantah je bil FD podizražen, medtem ko za FT ni bilo opaznih sprememb. S tem eksperimentom so potrdili značilni fenotip zaostalega cvetenja dvojnih mutant, saj so geni, ki so vključeni v represijo tega procesa nadizraženi, aktivatorji pa so podizraženi. Znanstvenike je zanimala odzivnost dvojnih mutant po tem, ko so bila semena dvanajst tednov izpostavljena vernalizacijskim pogojem. Opazovali so fenotip, torej cvetni čas in število rozetnih listov ter izražanje gena FLC divjega tipa in dvojnih mutant pri rastlinah, ki so bile izpostavljene pogojem vernalizacije in tistim, ki niso bile. Opazili so, da se je v dvojnih mutantah nivo transkripta gena FLC znižal in rastline so začele cveteti mnogo prej kot dvojne mutante v nevernatalizacijskih pogojih. Znanstveniki so želeli preučiti interakcije atVOZ proteinov s specifičnimi promotorji genov, ki so bili že predmet raziskav tekom te študije. Ustreznega zaporedja, znanega tudi kot vezavo mesto za VOZ, niso našli v nobeni promotorski regiji, niti gena FLC, niti njegovih regulatorjev kar nakazuje, da ni direktne povezave med TF-jema in prej opisanimi geni. Povezava pa je lahko posredna, zato so iskanje vezavega mesta za VOZ razširili na 1000 bp navzgor od promotorskih zaporedij. Našli so ustrezno vezavno mesto na promotorju gena Modifier of SNC1,3/Supressor of auxin resistance 3 (MOS3/SAR3), ki kodira jedrni membranski protein. V tem eksperimentu so znanstveniki želeli preučiti nivo izražanja MOS3/SAR3 v dvojnih mutantah ter preučiti interakcije atVOZ proteinov z DNA zaporedjem gena MOS3/SAR3 s pomočjo testa zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). Ugotovili so, da je gen MOS3/SAR3 nadizražen in da je vezava atVOZ2 na promotorsko regijo MOS3/SAR3 odvisna od koncentracije proteina. Poleg tega pa so tudi dokazali, da se atVOZ2 na vezavno mesto za VOZ veže s Zn2+ vezavno domeno in tako regulira izražanje gena MOS3/SAR3. To so prav tako določili z metodo EMSA, le da so opazovali vezavo mutiranega atVOZ2 proteina, z mutacijami narejenimi v vezavni domeni, na promotorsko regijo ter vezavo atVOZ2 na vezavnem mesto za VOZ, znotraj katerega je bila narejena mutacija. Zaradi težav pri izražanju atVOZ1 proteina tega zanj niso mogli dokazati, ampak so do podobnih rezultatov prišli z metodo kromatinske imunoprecipitacije (ChIP).

ZAKLJUČEK

Raziskava potrjuje pomembno vlogo transkripcijskih faktorjev atVOZ1 in atVOZ2 v regulaciji prehoda iz vegetativne rasti v cvetenje. Z različnimi eksperimenti, ki si sledijo v logičnem zaporedju so dokazali, da imajo rastline (atVOZ1-1 atVOZ2-1) daljši čas cvetenja, kadar le-tega primerjamo z divjim sevom. Dvojni mutanti so občutljivi na vernalizacijo kar se vidi v fenotipu, ki je podoben divjemu sevu in v znižanju izražanja gena FLC. Prav tako pa so dokazali, da transkripcijska faktorja posredno vplivata na gene, ki sodelujejo pri prehodu iz vegetativne rasti v cvetenje, in zagotovo ima del vloge pri tem gen MOS3/SAR3, na katerega transkripcijska faktorja delujeta neposredno.

ČLANEK

CELESNIK, H., ALI, G. S., ROBISON, F. M. & REDDY, A. S. 2013. Arabidopsis thaliana VOZ (Vascular plant One-Zinc finger) transcription factors are required for proper regulation of flowering time. Biol Open, 2, 424-31. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3625871/