Replikacija DNA pri arhejah

Uvod

Kot vemo so arheje bolj sorodne evkariontom kot bakterijam. To se kaže, poleg drugih podobnih lastnosti, ki jih imajo arheje z evkarionti, tudi v njihovi replikacijski mašineriji. Veliko različnih študij pri arhejah je raziskovalo mesta ori, iniciatorje, markomolekulske komplekse, katere so ključnega pomena za razvitje DNA in sintezo nascentne verige. Rezultati na podlagi različnih organizmov domene arhej kažejo veliko mero diverzitete. Vse od organizacije celičnega cikla, do ploidnosti kromosomov in replikativne narave polimeraz.

Regulacija replikacije

Celični cikel

Regulacija celičnega cikla v arhejah je ključna za natančno podvojevane DNA. Podobno kot pri evkariontih in bakterijah, se tudi v arhejah replikacija DNA usklajeno izvaja z drugimi celičnimi procesi. Aktivacija replikacijskih proteinov in natančen čas replikacije ima velik pomen za pravilno podvojevane DNA. Celični cikel arhej se lahko razlikuje glede na vrsto. Na splošno vključuje podobne faze kot pri evkariontih in bakterijah. Cikel je razdeljen na predreplikacijsko G1 fazo, S-fazo (kjer se zgodi replikacija genoma), postreplikacijsko G2 fazo ter M in D fazi, ko pride do segregacije genoma in delitve celic. Najdaljša faza je G2, ki traja več kot polovico celičnega cikla. To je v nasprotju z evkarionti, kjer je faza G2 kratka.

Regulacija podvojejvanja DNA

Regulacija iniciacije podvojevana DNA in vzorec izražanja genov je raznolik tudi med tesno sorodnimi vrstami Arhej, obstaja namreč velika variabilnost v genomu. Večina vrst arhej ima poliploiden zapis DNA, vendar pa nekatere vrste kot je Crenarchaeal phylum vsebujejo samo en zapis genoma. Pri arheji Sulfolobus solfataricus je številčnost proteinov Cdc6 specifična glede na celični cikel. Ekspresija Cdc6 se poveča v fazi G1 ali tik pred njo, zmanjša pa se v fazi S in se znatno zmanjša v celicah, ki se ne podvajajo. Pri arheji Sulfolobus acidocaldarius izražanje Cdc6-1 in Cdc6-3, kot tudi njuna vezava na izvoru, ostaja konstantno v celotnem celičnem ciklu, tudi v fazi, ko se ne delijo.

Med vrstami arhej prihaja tudi do velike raznolikosti v številu mest začetka replikacije. Več izvorov replikacije na kromosom poveča kompleksnost regulacije iniciacije replikacije. Pri Sulfolobus acidocaldarius, vrsti s tremi izvori replikacije na kromosom, obstaja tesna koordinacija začetkov dveh izvorov replikacije (oriC1 in oriC3) na začetku S-faze, medtem ko se tretji izvor, oriC2, aktivira nekoliko kasneje. Mehanizmi, ki zagotavljajo sočasen pričetek replikacije, niso znani.

Funkcija mesta ori

Za vse do sedaj opisane bakterije velja, da imajo en ori na kromosom. Veliko arhejskih genomov je sestavljenih podobno kot pri bakterijah, tj. iz glavnega kromosoma, lahko pa tudi vsebuje nekaj megaplazmidov. Prva opisana iniciacija replikacije pri arhejah je bila pri Pyrococcus abyssi. Odkrili so, da ima en ori. Kljub temu prvemu odkritju, je v bistvu ta arheja je neke vrste anomalija, saj v resnici imajo arheje več ori mest na kromosom. Npr. Haloferax ima tri in Pyrobaculum calidifontis ima štiri ori mesta na kromosom. Pomemben testni sev je Sulfolobus, ki ima tri ori mesta. Dokazano je bilo, da divje celice tega seva uporabljajo vse tri ori-je in da noben ori ni individualno potreben za normalno podvojevanje.

Veliko arhej si deli podoben tip ori. Pri sevu Sulfolobus imamo Orc1-1, ki se veže na oriC1. Bolj natančno se veže na elemente znotraj ori-ja, ki se imenujejo origin recognition box (ORB) elements. (Slika 1a - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7712474/figure/F1/). Elementi ORB imajo diadno simetrijo z asimetričnim zaporedjem, bogatim z G na eni strani diadnega elementa. Na vsak element ORB se veže en monomer Orc1-1 z določeno polarnostjo. Proteini Orc1/Cdc6 imajo N-končno AAA+ zvitje in C-končno domeno imenovano winged helix (wH). AAA+ je velika družina NTPaz, torej vsebujejo NTP vezavno domeno in katalitičen modul. Domeno wH najdemo pri transkripcijskih sistemih in predstavlja podrazred motiva helix-turn-helix. Domena wH prepoznava diadni element ORB-ja in domeno AAA+, ki je bogata z α-vijačnicami, imenovano iniciator specifičen motiv (ISM). ISM prepozna asimetričen z G bogat motiv. Število elementov ORB se med vrstami razlikuje. Skupna značilnost je, da se dva elementa ORB pojavljata v obrnjeni konformaciji glede eden na drugega in sta ločena minimalno 75 bp. To so običajno z AT bogate regije, torej so kandidat za DNA unwinding element (DUE). In vitro rekonstrukcijski eksperimenti so pokazali, da Orc1-1 rekrutira helikazo na oriC1 in le ta je odvisna od površine, ki je izpostavljena α-vijačni regiji (MCM recruitment motif, MRM) blizu wH Orc1-1 AAA+ domene. Na to interakcijo je pomembno vplival nukleotidni kofaktor, ki se veže na Orc1-1 AAA+ domeno. Bolj specifično, stabilizirali so ATP v aktivnem mestu, npr. z mutacijo domene AAA+, motiv Walker B, ak ostanek glutamat (E147), ostanka udeleženega pri hidrolizi ATP. Ugotovili so, da bi lahko Orc1-1 E147 pomagal pri vezavi MCM in vitro in pomagal pri oriC1 replikaciji in vivo. Po drugi strani, ko je bilo aktivno mesto zasedeno z ADP, je zmožnost interakcije MRM z MCM opuščena. Ta opažanja kažejo na to, da je aktivacija ori mesta odvisna od vezanega ATP na Orc1-1. (Slika 1b). prikazuje razprtje DNA in napredovanje MCM. MCM napreduje po DNA verigi z N-koncem naprej, tj. 5'→ 3'. Torej morata MCM-ja iti eden mimo drugega. Ko sta vezana na obe verigi DNA to ni mogoče, zato se mora DNA čisto razpreti, da lahko MCM helikazi vežeta na eno verigo in nadaljujeta vsaka v svojo smer.

Pri evkariontih je ključni korak iniciacije DNA replikacije asociacija kompleksa Cdc45, MCM in GINS. Podobno je tudi pri arhejah. Pri Sulfolobus acidocaldarius so rekonstruirali kompleks iz Gins23, Gins15 in Cdc45, ki so ortologi evkariontskih, in ugotovili da so v razmerju 2:2:2. (Slika 2 - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7712474/figure/F2/). Bistvo je, da so ugotovili, da GINS tvori pomembno povezavo med MCM in Cdc45.

Arhejska primaza

Delovanje primaze

Arhejska primaza je nizko procesivna RNA polimeraza, ki za model sinteze uporabi enojno vijačnico znotraj replikacijskega mehurčka in je zadolžena za sintezo oligoribonukleotidnega primerja. Oligoribonukleotidni primer običajno vsebuje 10 do 12 nukleotidov, ki so komplementarni nukleotidom na matični verigi DNA in služi kot začetna točka podaljševanja nove verige za DNA polimerazo. Pri sintezi vodilne verige je primazna aktivnost potrebna le enkrat. Na zastajajoči verigi pa je primazna aktivnost konstanta, saj se Okazakijev fragment začne na vsakih 100-200 nukleotidov, kar zahteva ponavljajočo se primazno aktivnost. V arhejah Sulfolobusu je bilo dokazano, da primaza interagira s kompleksom GINS, kar ponuja mehanizem za koordinirano sintezo primerjev s potekom replikacije v replikacijskih vilicah. Kompleks GINS pomaga pri odvijanju dvojne vijačnice DNA in s tem ustvarja smerno napredujočo replikacijsko vilico, ki omogoča, da primaza sintetizira primer na pravem mestu.

Zgradba primaze

Arhejska primaza ima dve podenoti, katalitična podenote PriS in regulatorne podenote PriL, ki sta skupna vsem vrstam arhej. PriS in PriL v arhejah sta ortologna primaznemu kompleksu DNA-polimeraze α primaze v evkariotskih celicah, zato se PriSL imenuje tudi arhejska evkariontska primaza (AEP). Proteini sorodni AEP so bili najdeni v izvenkromosomskih proteinih tako evkariontih kot tudi v bakterijskih celicah. PriSL je bil biokemično opisani pri številnih vrstah arhej in je pokazal sposobnost začetne sinteze tako RNA kot tudi DNA. Študije na primzah arhejah Archaeoglobus in Pyrococcus so pokazale, da ima primaza vlogo tudi pri popravilu DNA. Pri proučevanju arheje Sulfolobus so ugotovili, da poleg PriS in PriL ima primaza še tretjo podenoto PriX (Slika 3 - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7712474/figure/F3/). PriX naj bi signifikantno povečala procesivnosti encima in stabilizirala celoten kompleks. Kompleks bi tako tvoril heterotrimer. Študije so pokazale, da sta podenoti PriX in PriL v arhejah skupaj strukturno enaki podenoti PriL (p58) v evkariontih. Evkariontski PriL interagira s 5' koncem RNA primerjem v na modelni verigi. Pri arhejah Sulfolobus pa s 5' koncem interagira PriX in tako služi kot vezavno mesto za začetni nukleotid pri sintezi primerja.

DNA polimeraza

V poznih devetdesetih so ugotovili, da imajo prave arheje DNA polimerazo (DNAP), ki se filogenetsko razlikuje od vseh do takrat znanih celičnih DNA polimeraz, zato so jo umestili v novo družino, imenovano družina polimeraz D (PolD). PolD je heterodimerni protein, sestavljen iz dveh podenot (proteinov DP1 in DP2) z vsemi funkcijskimi značilnostmi replikacijske DNAP, vendar s katalitskim jedrom RNA polimeraze (RNAP). Kasneje so potrdili, da so polimeraze iz te družine v vseh vrstah arhej razen v krenarhejah. Številne arheje vsebujejo tudi DNAP, ki pripada družini polimeraz B (PolB). Izkazalo se je, da je PolD replikacijska polimeraza, ki je ključna komponenta arhealnega riplosoma, saj je odgovorna za iniciacijo replikacije DNA tako na vodilni kot tudi zastajajojoči verigi. Sestavljena je iz velike katalitske podenote DP2 in majhne podenote DP1 s 3′ → 5′ eksonukleazno aktivnostjo, ki služi kontrolnemu branju. PolB večinoma niso nepogrešljive za preživetje arheje, vendar se njihova vloga v celicah razlikuje, na primer: PolB1 ima pomembno vlogo pri povečanje učinkovitosti zorenja Okazakijevih fragmentov, saj preprečuje nepotrebno ponovno sintezo DNA med samim procesom.

Podenota DP1

Ugotovili so, da podenota DP1 pripada družini fosfodiestraz, njeno aktivno mesto pa je edinstveno za družino PolD. Analize aminokislinskega zaporedja so pokazale, da je podenota DP1 podobna majhni podenoti evkariontske DNA polimeraze δ (iz družine polimeraz B), ki je esencialna za replikacijo evkariontskih celic. Hkrati je tudi struktura DP1 tesno povezana s podenoto B evkariontskih PolB, ki je sicer izgubila katalitsko mesto, povezano z eksonukleazno aktivnostjo, kar nakazuje, da bi se lahko polimeraze B razvile iz polimeraz D. DP1 je sestavljena iz dveh domen: oligonukleotid vezavne domene (OB) in N-končne nukleazne fosfodiestrske domene (PDE), ki jo sicer najdemo v številnih hidrolazah, vendar je funkcija, povezana s kontrolnim branjem DNAP, specifična samo za PolD. Njeno aktivno mest je obrnjeno proti 3' koncu nastajajoče verige DNA.

Podenota DP2

Katalitska podenota DP2 je edinstvena za družino encimov PolD, saj pri analizah poravnav zaporedij in struktur niso našli dobrega ujemanja z ostalimi proteini. Vsebuje le posamezne motive, ki so značilni za katalitske podenote RNA polimeraz (RNAP). Od ostalih polimeraz se razlikuje tudi v katalitskem središču, ki je običajno v tako imenovani domeni dlani in jo delimo na dva podtipa glede na topologijo strukture aktivnega mesta. Lahko so tipa Klenow ali Polβ-podobno, medtem ko imajo PolD specifično dvojno psi β-sodčasto zvitje, ki je značilno za RNAP. Torej PolD spada v novo družino polimeraz, ki lahko vršijo od DNA odvisno sintezo RNA ali DNA oziroma od RNA odvisno sintezo RNA, kar prvič združi DNA replikacijo in transkripcijo znotraj iste družine proteinov. Drsna vponka je sestavljena iz dveh polipeptidnih, in sicer drsne vponke 1 in drsne vponke 2, ki tvorita osrednjo votlino s premerom 30 Å, in popolnoma obdata DNA. Drsna vponka 1, ki je sestavljen iz petih alfa-vijačnic in domene Zn-III, je z ene strani obrnjen proti katalitskemu centru polimeraze, z druge strani pa proti katalitskemu centru nukleaze. DP2 se z DP1 poveže na C-končni strani preko Zn-povezovalne domene. Ta povezave je potrebna za konformacijsko spremembo DP2 katalitske domene, ki sicer ne bi bila aktivna. Drsna vponka 2 je večinoma sestavljen iz štirih alfa-vijačnic, ki tvorijo elektro pozitivno območje, potrebno za interakcijo z novonastalo DNA. Domeni Zn-I in Zn-II prispevata predvsem k stabilizaciji drsne vponke 2. Afiniteta PolD za dvoverižno DNA je šibkejša kot za enoverižno DNA, kar nakazuje, da se PolD prednostno veže na matrično DNA, zato predvidevajo, da se PolD vključi hitro za iniciacijo primaze, v kasnejši stopnji pa se zgodi zamenjava, tako da PolB postane odgovorna za replikacijo vodilne verige, medtem ko PolD nadaljuje z replikacijo zastajajoče verige.

Viri

1. AUSIANNIKAVA, Darya in ALLERS, Thorsten, 2017. Diversity of DNA Replication in the Archaea. Genes. 31 januar 2017. Vol. 8, no. 2, pp. 56. DOI 10.3390/genes8020056.

2. GRECI, Mark D. in BELL, Stephen D., 2020a. Archaeal DNA Replication. Annual review of microbiology. 8 september 2020. Vol. 74, pp. 65–80. DOI 10.1146/annurev-micro-020518-115443.

3. LINDÅS, Ann-Christin in BERNANDER, Rolf, 2013. The cell cycle of archaea. Nature Reviews Microbiology. september 2013. Vol. 11, no. 9, pp. 627–638. DOI 10.1038/nrmicro3077.

4. RAIA, Pierre, CARRONI, Marta, HENRY, Etienne, PEHAU-ARNAUDET, Gérard, BRÛLÉ, Sébastien, BÉGUIN, Pierre, HENNEKE, Ghislaine, LINDAHL, Erik, DELARUE, Marc in SAUGUET, Ludovic, 2019. Structure of the DP1–DP2 PolD complex bound with DNA and its implications for the evolutionary history of DNA and RNA polymerases. PLoS Biology. 18 januar 2019. Vol. 17, no. 1, pp. e3000122. DOI 10.1371/journal.pbio.3000122.

5. Shared active site architecture between archaeal PolD and multi-subunit RNA polymerases revealed by X-ray crystallography - PMC, brez datuma. na spletu. [Pridobljeno 10 maj 2023]. Pridobljeno s: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4996933/#S1