Retrovirusi

Retrovirusi so eni izmed najbolje raziskanih živalskih virusov. Spadajo med RT viruse, ki svoj genom podvojujejo z reverzno transkripcijo. V to skupino spada še družina hepadnavirusov, katerih genom je DNA (hepatitis B), genom retrovirusov pa je RNA. Za reverzno transkripcijo je značilno, da se informacija prenese v smeri, ki je v nasprotju s centralno dogmo, in sicer iz RNA nazaj v DNA. Pri procesu sodeluje encim reverzna transkriptaza.

Klasifikacija

Retroviruse v glavnem delimo na enostavne in kompleksne. Značilen predstavnik enostavnega retrovirusa je MLV (murine leukemia virus), kompleksnega pa virus HIV. Včasih so jih delili glede na patologijo (onkovirusi, lentivirusi in spumavirusi), danes pa glede na strukturo in organizacijo genoma (7 rodov).

Struktura

VIRION je sferične oblike in ima premer okoli 100 nm. Ovojnico, ki nastane z brstenjem iz plazemske membrane, sestavljata v glavnem dve vrsti glikoproteinov. To so zunanji površinski proteini in transmembranski proteini. Na notranji strani ovojnice so proteini matriksa. Kapsida je ikozaedrična ali stožčasta, sestavljajo jo kapsidni proteini. Znotraj kapside se nahajajo še trije virusni proteini, ki delujejo kot encimi. To so reverzna transkriptaza, proteaza in integraza.

GENOM retrovirusov predstavljata dve kopiji pozitivno usmerjene RNA. Shranjeni sta kot dimer in obdani z nukleokapsidnimi proteini. V dimer sta povezani preko interakcije med posebnima nukleotidnima zaporedjema na vsaki verigi, imenovanima 'kissing loop'. Na 5' koncu je metilirana kapa, na 3' koncu pa poli(A) rep. Tako na 5' kot na 3' koncu sta 150-200 nt dolgi ponavljajoči regiji (R), v osrednjem delu genoma pa so kodirani virusni proteini. Različni rodovi virusov imajo na genom vezano različno vrsto tRNA. Enostavni retrovirusi imajo v genomu zapis za tri poliproteine: Gag (skupinsko-specifični antigen), Pol (polimeraza) in Env (proteini ovojnice). Za poliproteine je značilno, da jih sestavlja več polipeptidnih verig, ki se kasneje (v procesu splicinga) ločijo na posamezne funkcionalne polipeptide. Kompleksni retrovirusi poleg omenjenih treh poliproteinov kodirajo še šest drugih. To so Vpr, Vif, Vpu, Tat, Rev in Nef.

Virus HIV

HIV je prototip kompleksnega retrovirusa. Splošno znan je predvsem zato, ker pri človeku povzroča AIDS. Po zgradbi je precej podoben enostavnim retrovirusom, le kapsida je drugačne, ikozaedrične oblike. Tudi njegov genom je nekoliko kompleksnejši in večji od genoma enostavnih retrovirusov. HIV glede na zgradbo genoma delimo še na dva genotipa, HIV-1 in HIV-2. AIDS povzroča HIV-2, ki se od HIV-1 razlikuje po tem, da ima v genomu namesto proteina Vpu zapis za Vpx.

Življenjski cikel

Življenjski cikel retrovirusov poteka v dveh fazah. V zgodnji fazi virus vstopi v gostiteljsko celico, ustvari DNA kopijo svoje virusne RNA in jo vstavi v gostiteljski genom. V pozni fazi življenjskega cikla pa se izrazi virusna RNA, poteka sinteza virusnih proteinov in sestavljanje virionov.

Vstop v celico

Enostavni retrovirusi se na gostiteljsko celico pritrdijo preko virusnih receptorjev in vstopijo v celico z endocitozo s fuzijo zaradi znižanja pH v endosomu, medtem ko kompleksni retrovirusi vstopijo v celico pretežno z direktno fuzijo s celično membrano. Kompleksni retrovirusi potrebujejo za vstop v celico poleg glavnega receptorja CD4 tudi kemokinski koreceptor CCR5 ali CXCR4.

Reverzna transkripcija

Med transportom reverzno-transkripcijskega kompleksa RTC do jedra gostiteljske celice poteka proces reverzna transkripcija, pri katerem se enoverižna virusna RNA prepiše v dvoverižno DNA s pomočjo encima reverzne transkriptaze, ki ima dve aktivnosti: RNA/DNA odvisno DNA polimerazno aktivnost in ribonukleazno H aktivnost. Proces se začne z vezavo tRNA molekule na PBS (primer-bonding site) virusne RNA, ki služi kot primer za začetek sinteze DNA. Sinteza poteka od 3' proti 5' koncu virusne RNA, pri čemer nastane kratka negativno usmerjena DNA molekula, ki je kopija U5 in R regije. RNaza H odstrani RNA del novonastalega DNA-RNA hibrida in tako izpostavi DNA kopijo U5 in R zaporedij. Slednje hibridizira z R zaporedjem virusne RNA in novonastala DNA molekula se prenese na 3' konec. Reverzna transkriptaza sintetizira kopijo celotnega RNA genoma, ki vsebuje zaporedje U3-R-U5 ali LTR (long terminal repeat). Ribonukleazni del encima nato razgradi vso virusno RNA, razen polipurinskega področja, ki v nadaljevanju služi kot primer za sintezo druge kratke pozitivno usmerjene verige DNA. Ko se ta sintetizira, RNaza H razgradi še polipurinski primer in tRNA s prve verige, pri čemer se izpostavi PBS vezavno mesto na drugi verigi. To hibridizira s komplementarnim zaporedjem prve verige DNA in novo sintetizirana druga veriga se prenese na 3' konec. Proces se zaključi s podaljšanjem obeh verig DNA, pri čemer nastane linearna dvoverižna DNA (provirusna DNA), ki ima na obeh koncih LTR zaporedje. Reverzna transkriptaza retrovirusov nima 3'→5' eksonukleazne aktivnosti, ki jo celične DNA polimeraze uporabljajo za popravljanje napak zaradi česar obstajajo retrovirusi v številnih variacijah.

Vstop v jedro in integracija

Provirusna DNA je vezana v predintegracijskem kompleksu (PIC). Sama velikost tega kompleksa mu preprečuje vstop v jedro skozi jedrne pore, zato večina retrovirusov vstopi v jedro med fazo M celičnega cikla, ko jedra ovojnica razpade. Posledično lahko enostavni retrovirusi okužijo samo celice, ki se delijo. To pa ne velja za kompleksne lentiviruse, kot je HIV, saj ti kodirajo za proteine, ki omogočajo aktivni transport PIC skozi jedrne pore in lahko okužijo celice tudi v mirujočem stanju. To lastnost s pridom izkoriščajo v laboratorijih, kjer uporabljajo lentivirusne vektorje za dostavo genov v celična jedra. Po vstopu v jedro sledi integracija provirusne DNA v genom gostitelja, kar ji omogoča podvojevanje hkrati z gostiteljskim genomom in nastanek novih virusnih proteinov. Integracijo katalizira virusna integraza, ki se veže na oba 3' konca linearne virusne DNA, odstrani dva končna nukleotida in združi virusno DNA z gostiteljsko. Integracijska mesta so naključno razporejena po gostiteljskem genomu, sama integracija pa je ireverzibilna.

Transkripcija

Provirusna DNA služi kot matrica za prepisovanje retrovirusne RNA. Transkripcija poteka z RNA polimerazo II gostiteljske celice. Provirusna DNA vsebuje dve identični LTR zaporedji. 5' LTR, ki vsebuje signal za iniciacijo transkripcije in 3' LTR, ki vsebuje signal za posttranskripcijsko procesiranje. Transkripcija se začne na stiku med U3 in R regijo na 5' LTR koncu in se nadaljuje vzdolž celotnega genoma do regije U5 na 3' LTR koncu. U3 regija je razdeljena na dva dela, na promotor in ojačevalec (enhancer), na oba se lahko vežejo pozitivni regulatorji transkripcije. Promotor vsebuje škatlo TATA, na ojačevalec se lahko vežejo proteini, ki prepoznajo to zaporedje. Pri transkripciji HIV-1 ima ključno vlogo protein Tat. Ekspresija Tat proteina znatno poveča količino virusne RNA v okuženih celicah tako, da se veže na TAR (Tat-responsive element) zaporedje na nastajajoči RNA. Zaporedje Tat z vezavo na zaporedje TAR poveča procesivnost RNA polimeraze II tako, da povzroči hiperfosforilacijo C-končne domene na RNA polimerazi II. Tat vezan na TAR deluje kot antiterminator virusne transkripcije. Po transkripciji pride do dodajanja kape na 5' koncu, poliadenilacije na 3' koncu in rezanja transkripta. Genomska RNA, ki ima celotno dolžino, služi kot mRNA za translacijo Gag/Pol poliproteinov ali kot matrica za reverzno transkripcijo. Rezana oziroma subgenomska RNA pa služi kot mRNA za translacijo Env poliproteinov.

Transport iz jedra v citoplazmo

Za transport iz jedra v citoplazmo je ključen protein Rev, ki se veže na zaporedje RRE (Rev-responsive element) na mRNA. Rev in mRNA se skupaj preneseta iz jedra s pomočjo eksportinov.

Translacija

Nerezana, genomska RNA sintetizira Gag in Gag/Pol poliproteine. Za sintezo teh dveh poliproteinov iz ene same mRNA je potrebna modifikacija normalne translacije. Pri MLV virusih je pomemben UAG stop kodon, ki ločuje med Gag in Pol bralnim okvirjem. Če je stop kodon prepoznan, pride do sinteze Gag poliproteinov. Nekajkrat pa glutamin-tRNA prebere UAG stop kodon kot CAG in tako v polipeptidno verigo vstavi glutamin, takrat je terminacija translacije zavrta in sintetizira se Gag/Pol fuzijski protein. Za proces pravilnega prepoznavanja stop kodona je ključna sekundarna struktura RNA – pseudoknot. Pri virusih HIV imata proteina Gag in Pol drugačen bralni okvir. Pri translaciji pride do premika bralnega okvirja (ribosomal frameshifting) za en nukleotid nazaj. Prednost za translacijo dveh proteinov iz ene mRNA je, da sta proteina sintetizirana v določenem razmerju, vedno bo več proteina Gag kot Gag/Pol.

Sestavljanje in pakiranje virusa

Sestavljanje se začne v citoplazmi, kjer se Gag veže na genomsko RNA. Gag/RNA kompleks se s pomočjo maščobne kisline miristata transportira do plazmaleme, kjer pride do sestavljanja kapside. Pakiranje genomske RNA sproži signal za pakiranje-psi, ki se nahaja na 5' koncu RNA.

Sprostitev in zorenje virusa

Sestavljanje Gag poliproteinov ob plazmalemi povzroči, da se membrana rahlo ukrivi. L domena, kodirana na Gag ima odločilno vlogo da spodbudi ESCRT sistem za proizvajanje multivezikularnih teles. Nukleokapsida sproščenih virionov je sestavljena iz Gag ali Gag/Pol. Ko so virioni sproščeni iz celice, postane aktivna virusna proteaza, ki cepi Gag in Gag/Pol poliproteine v strukturne in encimske proteine. Ti proteini se premestijo tako, da tvorijo elektronsko gosto jedro zrelega viriona. Zorenje virusa je nujno, kajti le zreli virusi lahko okužijo novo celico.

Kako retrovirusi vplivajo na gostiteljske celice

Glede na vpliv na gostiteljsko celico retroviruse delimo na akutno transformirajoče in netransformirajoče. Oboji lahko v okuženih celicah povzročijo prekomerno rast in delitev, kar vodi v pojav raka. Akutno transformirajoči virusi v celice vnesejo virusne onkogene. V genomu lahko kodirajo mutirane oblike celičnih signalnih proteinov povezanih s celično rastjo. Netransformirajoči virusi pa lahko preko naključne integracije provirusne DNA v genom gostiteljske celice na mesta, ki kodirajo proto-onkogene, povzročijo mutacijo le-teh.

Viri

1. Suzuki, Y. & Craigie, R. The road to chromatin - Nuclear entry of retroviruses. Nat. Rev. Microbiol. 5, 187–196 (2007).

2. Acheson, N. H. Fundamentals of Molecular Virology Textbook. 2007, (2011).

3. Ryu, W.-S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses (2017). doi:10.1016/B978-0-12-800838-6.00021-7

4. Coffin, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. Retroviruses. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997).