S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah

S-POP je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 zasnovala in izvedla skupina Stockholm. Končni cilj projekta je bila priprava modularnega biosenzorskega sistema kot alternativo trenutno uveljavljenim postopkom za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v Baltskem morju.

Spletna stran projekta S-POP, iGEM 2020, Stockholm: https://2020.igem.org/Team:Stockholm

Avtor povzetka: Tadej Medved

POP – obstojna organska onesnaževala

Obstojna organska onesnaževala (označena s kratico POP) so skupina toksičnih hidrofobnih spojin, ki so zelo odporna na fotolitsko, kemijsko in metabolično razgradnjo [1]. Mednje uvrščamo poliklorirane bifenile oz. PCB-je in perfluoroalkilno kislino PFOS [2]. Razpolovna doba le-teh doseže 5-10 let [1]. To predstavlja velik problem za večino ekosistemov, saj se POP-i zlahka nabirajo v lipofilnih tkivih rastlinskih in živalskih organizmov, kjer se njihova koncentracija sčasoma povečuje [2],[3]. Še posebej so prizadeti morski ekosistemi, kot je Baltsko morje, saj so bili v preteklosti prejemniki odpadnih voda z velikimi količinami POP-ov. Za učinkovito ukrepanje pri zajezitvi širjenja tovrstnih onesnaženj vodnih okolij je treba izvajati konstantno analizo vodnih vzorcev, kar pa je v okviru trenutnih standardnih metod (HPLC) zamudno, finančno neugodno in podvrženo napakam pri stopnji vzorčenja [4].

Projekt S-POP

Zasnova projekta je sistem S-POP, ki je sestavljen iz dveh modulov: biosenzorja in oscilatorja. Biosenzor zaznava PCB-je ali PFOS in to sporoči oscilatorju. Oba modula sta vgrajena v mikrobno gorivno celico, ki oscilatorjev signal pretvori v merljiv električni tok.

Biosenzor

Ker velika večina iGEM skupin pripravi svoje konstrukte za transformacijo E. coli, in ker je laboratorijsko delo s to bakterijo zelo enostavno in prilagodljivo, so si za biosenzor izbrali sev kompetentnih celic E. coli Top10. Pripravili so dva konstrukta za transformacijo teh celic: za zaznavanje PFOS in za zaznavanje PCB-jev. Oba konstrukta sta pod inducibilnim promotorjem vsebovala zapis za LuxI, ki sintetizira 3OC6-HSL, signalno molekulo pri zaznavanju celične gostote [5]. Transkripcija se inducira le v prisotnosti PFOS ali PCB-jev. Signal 3OC6-HSL je potreben za polno aktivacijo oscilatorja.

Za zaznavanje PFOS so uporabili inducibilni promotor prmA iz Rhodococcus jostii; ustrezno biokocko je leto prej že pripravila iGEM skupina USAFA (BBa_K2911000). Pri tem promotorju je dokumentirano 3-kratno povečanje transkripcije pri 100 μM koncentracijah perfluoroalkilnih kislin, kot je PFOS [6]. Končni konstrukt je vseboval promotor PprmA in zapis za LuxI. Končni biološki del je BBa_K3440005.

V primeru PCB-jev so uporabili dvodelni sistem bphr1/2 iz Pseudomonas furukawaii KF707. Prvi del sistema obsega konstitutiven Andersonov promotor in zapis za protein BphR2, drugi del je pa sestavljen iz inducibilnega promotorja Pbphr1 in zapisa za LuxI. BphR2 je transkripcijski regulator iz katabolične poti bifenilov, na katerega se lahko vežejo derivati bifenila, med njimi nekateri PCB-ji [7]. V prisotnosti teh spojin se veže na operatorje Pbphr1 in močno inducira transkripcijo. Iz varnostnih razlogov so za preverjanje delovanja biosenzorja namesto PCB-jev uporabili manj toksičen analog, 1,1'-bifenil. Končni biološki del je BBa_K3440018.

Oscilator

Shewanella oneidensis je fakultativno anaerobna gramnegativna bakterija, katere sev MR-1 se pogosto uporablja v mikrobnih gorivnih celicah zaradi značilne sposobnosti reduciranja okoliških kovin v anoksičnih pogojih. Te kovine delujejo kot končni akceptorji elektronov, s čimer nastane elektrokemijski gradient, ki celicam nudi zadostno kemijsko energijo za rast. Posebnost S. oneidensis je tudi ta, da lahko tvori nitatste zunajcelične strukture, po katerih se lahko elektroni preko citokromov prenašajo tudi do kovin na mikrometrskih in večjih razdaljah, kar je ključno za tvorbo biofilma [8]. Pri elektronski prenašalni verigi in pritrjevanju biofilma je ključnega pomena protein MtrB v zunanji membrani, ki skrbi za lokalizacijo citokromov in jih povezuje z elektronskimi prenašalci v periplazmi. Sevi Δmtrb imajo močno zmanjšano sposobnost redukcije kovin, zato je MtrB uporaben reporter v biosenzorskih sistemih, ki slonijo na proizvajanju električnega toka [9].

Oscilatorski sistem pri tem projektu je sestavljen iz treh komponent, ki so skupaj vključene v ekspresijski vektor. Prva je sestavljena iz konstitutivnega Andersonovega promotorja in zapisa za protein RhlR. RhlR je transkripcijski regulator, ki se veže na promotor Prhl – če ima vezan še homoserinlakton C4-HSL, se promotor aktivira [10]. Druga komponenta je policistronsko organizirana, z zapisi za proteine LuxR, RhlI in AiiA z vmesnimi RBS in pod kontrolo Prhl. LuxR je transkripcijski regulator, ki ob vezavi 3OC6-HSL aktivira promotor Plux, RhlI sintetizira C4-HSL, AiiA pa je laktonaza, ki razgrajuje C4-HSL. Tretja komponenta pa obsega Plux in zapis za MtrB [10],[11]. Vsi proteini imajo na C-koncu vključeno tudi oznako LVA, ki pospešuje njihovo razgradnjo in poskrbi za višjo frekvenco oscilacije.

Oscilacija poteka na sledeči način: RhlR se izraža konstitutivno, a v začetni točki zaradi odsotnosti C4-HSL ne more aktivirati Prhl. V resnici pa pride do puščanja tega promotorja, ki povzroči transkripcijo zapisa za RhlI med drugimi – s tem se poveča koncentracija C4-HSL, kar aktivira RhlR in omogoči indukcijo Prhl v pozitivni povratni zanki. Posledično pride do transkripcije in translacije LuxR, RhlI in AiiA v veliki meri. AiiA začne razgrajevati C4-HSL v negativni povratni zanki; pride do znatnega znižanja deleža aktivnega RhlR, transkripcija se upočasni, količina C4-HSL pa upade. Nato se zanka ponovi. Edina komponenta, ki je odvisna od 3OC6-HSL, je reporter MtrB. Ko biosenzorski modul zazna onesnaževalo v vzorcu, začne sproščati 3OC6-HSL, ki preide v oscilatorski modul in aktivira LuxR. Pričneta se transkripcija in translacija MtrB, kar povzroči električni signal. Ker koncentracija LuxR stalno niha, se koncentracija MtrB spreminja z isto periodo.

Končnem oscilatorskem modulu ustreza naprava BBa_K3440021.

Mikrobna gorivna celica

Za sistem S-POP so izbrali pretočno gorivno celico, sestavljeno iz grafitne katode in anode, ki ju razmejuje protonska izmenjevalna membrana. Elektrodi se nahajata v zatesnjenih komorah, skozi katere se dovaja konstanten pretok medija. Ta gorivna celica je hibridnega tipa: anoda je potopljena v hranilnem mediju, katodo pa se prepihava z zrakom. V komori z anodo je inokuliran oscilatorski sev, ki tvori biofilm na površini anode. Pogoji v komori so anaerobni, hranilni medij pa je minimalen in vsebuje laktat, ki je optimalen za nastanek biofilma [12]. Ko se MtrB izraža, prenesejo bakterije elektrone na anodo, hkrati pa v medij sproščajo protone, ki prehajajo skozi membrano do katode. Elektroni nato potujejo do katode, kjer reducirajo kisik do končnega produkta – vode. Med katodo in anodo je 1 kΩ upornik, na katerem se izmeri napetost.

Eksperimentalno delo in rezultati

Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo dokončno potrditi delovanja S-POP, so pa uspešno pripravili 22 bioloških delov za karakterizacijo posameznih komponent (promotorjev in kodirajočih zaporedij). Vse tako pripravljene biološke dele so ligirali v vektor pSB1C3 s pomočjo standardnih metod. Na žalost niso utegnili okarakterizirati vseh bioloških delov. Skoraj vse teste so opravili na transformiranih E. coli Top10.

Test viabilnosti

Za E. coli, transformirane z biosenzorskimi konstrukti za PFOS (BBa_K3440005) in PCB-je (BBa_K3440018), so želeli preveriti, če lahko ostanejo viabilne pri okoljskih in višjih koncentracijah onesnaževal (0,1 μM-1 mM bifenila in 7,81-125 μM PFOS). Za kontrolo so uporabili netransformirano kulturo E. coli Top10. Bakterijske kulture so inkubirali v hranilnem mediju z redčenim PFOS ali bifenilom ter merili OD₆₀₀ preko noči. Izmerjene rastne krivulje so začele odstopati od kontrol brez onesnaževal šele pri 1 mM bifenila ali 125 μM PFOS, ki pa so veliko večje koncentracije kot v naravi, zato bi zasnovan biosenzor v okoljskih pogojih ostal viabilen.

Karakterizacija promotorjev

Karakterizacijo promotorjev so izvedli s konstrukti, ki so vsebovali zapis za mCherry pod nadzorom Pbph1 (BBa_K3440001) in PprmA (BBa_K3440002) ali pa GFP pod nadzorom Prhl (BBa_K3440012) in Plux (BBa_K3440014), z ustreznim regulatorjem LuxR ali RhlR pod konstitutivnim promotorjem. Za negativni kontroli so imeli konstrukta z LuxI (BBa_K3440000) in RhlI (BBa_K3440006) pod konstitutivnim promotorjem. Izvedli so meritve tako v prisotnosti kot v odsotnosti induktorja (POP-ov ali AHL) za kvantifikacijo puščanja promotorjev. Prhl in Plux so v prvi seriji inducirali z inkubacijo s kontrolnima sevoma, v drugi seriji pa s sintetičnimi AHL. Merili so fluorescenco transformiranih bakterij na mikrotitrski plošči. V vseh primerih (razen pri kontrolah) so opazili puščanje v odsotnosti induktorja. POP-i niso povzročili zaznavne indukcije, AHL-ji pa so v obeh serijah. Delovanje inducibilnih promotorjev so dodatno preverili z NaDS-PAGE in prenosom western, kjer so gledali prisotnost posameznih proteinov v fuziji s c-Myc. Za inducibilne promotorje so dobili analogne rezultate kot pri fluorescenčni analizi, zapisi za nekatere proteine (BphR2) pa se niso izražali tudi pod konstitutivnim promotorjem. Pri prenosu western so uporabili sledeče biološke dele: BBa_K3440000, BBa_K3440006, BBa_K3440013, BBa_K3440008, BBa_K3440014, BBa_K3440012, BBa_K3440009, BBa_K3440010, BBa_K3440005, BBa_K3440018.

Test tvorbe biofilma

Da bi preverili sposobnost S. oneidensis MR1 za tvorbo biofilma na anodi, so izvedli dva poskusa z gorivno celico: v prvem so v anodno komoro inokulirali kulturo divjega tipa z aktivnim MtrB, v drugem pa so enako storili z Δmtrb sevom. V obeh primerih so čez več dni merili napetost kot posledico tvorbe biofilma in iz nje izračunali električni tok. V prvem poskusu so najprej skozi komoro z anodo pretakali gojišče LB, pri čemer je električni tok enakomerno naraščal do 20 μA. Nato so z menjavo LB odstranili bakterije, ki niso bile v biofilmu; posledično je tok po kratkem narasel do 130 μA. Z zamenjavo LB z minimalnim gojiščem z laktatom je tok močno upadel – šele po dodatku večje količine laktata se je izravnal pri 20 μA. V primeru Δmtrb so izmerili zelo nizek električni tok, ki je tekom eksperimenta ostal konstanten. Na koncu so gorivni celici razstavili in potrdili, da je pri sevu divjega tipa nastal biofilm, pri Δmtrb pa ne.

Zaključek

Kljub časovnim omejitvam je ekipa Stockholm uspešno pripravila teoretsko osnovo za dvodelni oscilirajoči biosenzor, prav tako pa so že dizajnirali vse potrebne konstrukte za njegovo implementacijo. Trenutni cilj ekipe je priprava delujočega oscilatorskega modula v laboratoriju, da ga lahko združijo z biosenzorskim modulom v gorivni celici. V najboljšem primeru bo S-POP v prihodnosti predstavljal enostavno alternativo za zaznavanje POP-ov v industrijskih in hišnih odpadnih vodah in bo lahko ključen za pravočasno odpravljanje virov teh kemikalij.

Viri

[1] G. W. Yu, J. Laseter in C. Mylander: Persistent Organic Pollutants in Serum and Several Different Fat Compartments in Humans. J. Environ. Public Health. 2011, str. 2011.

[2] L. L. Johnson, B. F. Anulacion, M. R. Arkoosh, D. G. Burrows, D. A. M. da Silva, J. P. Dietrich, M. S. Myers, J. Spromberg in G. M. Ylitalo: Effects of Legacy Persistent Organic Pollutants (POPs) in Fish-Current and Future Challenges. Fish Physiol. 2013, 33, str. 53-140.

[3] K. C. Jones in P. De Voogt: Persistent Organic Pollutants (POPs): State of the Science. Environ. Pollut. 1999, 100, str. 209-221.

[4] Understanding the Different PFAS Methods Available [citirano 10.4.2021]. Dostopno na: https://www.meritlabs.com/blog/2020/9/2/understanding-the-different-pfas-methods-available.

[5] A. L. Schaefer, D. L. Valt, B. L. Hanzelka, J. E. Cronan in E. P. Greenberg: Generation of Cell-to-Cell Signals in Quorum Sensing: Acyl Homoserine Lactone Synthase Activity of a Purified Vibrio Fischeri LuxI Protein (Autoinduction/Lux Genes/Cell Density-Dependent Gene Expression). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1996, 93, str. 9505-9509.

[6] T. S. Weathers, C. P. Higgins in J. O. Sharp: Enhanced Biofilm Production by a Toluene-Degrading Rhodococcus Observed after Exposure to Perfluoroalkyl Acids. Environ. Sci. Technol. 2015, 49, str. 5458-5466.

[7] J. Hirose, H. Fujihara, T. Watanabe, N. Kimura, H. Suenaga, T. Futagami, M. Goto, A. Suyama in K. Furukawa: Biphenyl/PCB Degrading Bph Genes of Ten Bacterial Strains Isolated from Biphenyl-Contaminated Soil in Kitakyushu, Japan: Comparative and Dynamic Features as Integrative Conjugative Elements (ICEs). Genes. 2019, 10, str. 404.

[8] S. Pirbadian, S. E. Barchinger, K. M. Leung, H. S. Byun, Y. Jangir, R. A. Bouhenni, S. B. Reed, M. F. Romine, D. A. Saffarini, L. Shi, Y. A. Gorby, J. H. Golbeck in M. Y. El-Naggar: Shewanella Oneidensis MR-1 Nanowires Are Outer Membrane and Periplasmic Extensions of the Extracellular Electron Transport Components. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014, 111, str. 12883-12888.

[9] B. Schuetz, M. Schicklberger, J. Kuermann, A. M. Spormann in J. Gescher: Periplasmic Electron Transfer via the C-Type Cytochromes Mtra and Fcca of Shewanella Oneidensis Mr-1. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75, str. 7789-7796.

[10] G. Medina, K. Juárez, B. Valderrama in G. Soberón-Chávez: Mechanism of Pseudomonas Aeruginosa RhlR Transcriptional Regulation of the RhlAB Promoter. J. Bacteriol. 2003, 185, str. 5976-5983.

[11] J. Pan, T. Huang, F. Yao, Z. Huang, C. A. Powell, S. Qiu in X. Guan: Expression and Characterization of AiiA Gene from Bacillus Subtilis BS-1. Microbiol. Res. 2008, 163, str. 711-716.

[12] G. E. Pinchuk, O. V. Geydebrekht, E. A. Hill, J. L. Reed, A. E. Konopka, A. S. Beliaev in J. K. Fredrickson: Pyruvate and Lactate Metabolism by Shewanella Oneidensis MR-1 under Fermentation, Oxygen Limitation, and Fumarate Respiration Conditions. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, str. 8234–8240.