Sekvenčno specifična protimikrobna sredstva

Uvod

Z večanjem števila bakterij odpornih na antibiotike, se manjša število možnosti zdravljenja bakterijskih okužb. Med antibiotike, ki jih imenujemo tudi »last resort« antibiotiki, spadajo karbapenemi – β-laktamski antibiotiki za okužbe z gram-negativnimi bakterijami. S širitvijo širokega spektra β-laktamaz med bakterijami, se je povečala potreba po uporabi karbapenov, širila pa se je tudi odpornost bakterij na karbapene z β-laktamazami. Ena izmed teh je New-Delhi metallo-β-laktamaza 1 (NDM-1), ki se hitro širi med enterobakterijami. Odpornost bakterij proti antibiotikom je zelo raznolika in otežuje zdravljenje. S CRISPR-Cas metodo bi lahko specifično odstranili neželjene gene, ki povzročajo odpornost na antibiotike.

Sistem CRISPR-Cas

Uporabili so CRISPR-Cas sistem tipa II, ki je značilen za bakterije Streptococcus pyogenes. Naravno Sistem CRISPR uporabljajo nekatere bakterije in arheje kot obrambo proti tujim plazmidom in fagom. V primeru CRISPR-Cas tipa II gre za RNA-usmerjeno nukleazo RGN (angl. RNA-guided nuclease), ki jo sestavlja endonukleaza Cas9, crRNA (angl. CRISPR RNA) in tracrRNA (angl. Trans-activating crRNA). Zapis za tarčno sekvenco je nosi crRNA, ki je zapisan na vmesnikih na CRISPR lokusu. Z manipulacijo tega zapisa lahko ustvarimo specifične endonukleaze, ki cepijo dsDNA na željenem mestu. V primeru odpornosti na antibiotike, lahko v bakterije vstavimo konstrukte z zapisi za Cas9, tracrRNA in crRNA, ki je usmerjena v gene odgovorne za pojav odpornosti. Konstrukt, ki ga vnesemo in s tem cepitev DNA, lahko deluje na bakterijski kromosom ali plazmid, odvisno od mesta gena za odpornost, medtem ko cepitev lahko vodi v izgubo plazmida ali citotoksičnost.

Specifičnost RGN

Ustvarili so RGN, ki so usmerjene v blaSHV-18 in blaNDM-1. Plazmide pRGNndm-1, pRGNshv-18, pRGNndm-1 ∆tracrRNA in pRGNndm-1Cas9D10A so transformirali v bakterije E.coli EMG2 divjega tipa in EMG2 z rezistencami SHV-18 in NDM-1 na kromosomih. Na gojišču s kloramfenikolom (Cm) so naredili selekcijo za transformante. V primeru manjšega števila preživetih bakterij glede na divji tip, je transformacija bakterij povzročila apoptozo. Transformacija v tarčnih celicah je povzročila 1000-kratno zmanjšanje preživelih glede na divji tip. Naredili so tudi analizo mutant, ki so ne glede na prejeti plazmid in tarčno sekvenco preživele. Toleranca je bila posledica mutiranih konstruktov. V primeru mutirane Cas9D10A ni bilo učinka na zmanjšanje bakterij.

Učinkovitost RGN na plazmide v visokem številu kopij

Dokazali so učinkovitost RGN v primeru plazmidov, ki se v celicah pojavljajo v visokem številu kopij. Uporabili so bakterije, v katere so transformirali vektorje z rezistenčnim markerjem (blaz in ndm-1). Vektorji so vsebovali ori mesto ColE1, ki omogoča vsebnost 50-70 plazmidov v bakteriji, in reporter GFP. Bakterije z GFP-ColE1 vektorji so transformirali s plazmidi CRISPR-Cas konstruktov za blandm-1. Transformacija s pblandm-1 v bakterijah s pZEblandm-1-GFP je bila 1000-krat manjša v primerjavi s kontrolnimi bakterijami z odpornostjo blaz. Sistem je učinkovit, saj so prav geni za odpornost na antibiotike pogosto prisotni na velikih plazmidih v visokem številu kopij.

Konstrukt usmerjen v spremembo enega nukleotida

Pogosta tarča za antibiotike kvinole je DNA-giraza A, odpornost na kvinole pa je posledica kromosomske mutacije DNA-giraze A na posameznem nukleotidu (D87G). Preverili so, če je sistem CRISPR-Cas dovolj občutljiv za tako subtilno mutacijo. Uporabili so seve E.coli EMG2 z mutirano girazo in bakteriofage s konstrukti RGNgyrAD87G. Bakteriofagi so bili za seve z mutacijo citotoksični, medtem ko na seve divjega tipa niso imeli učinka. GFP reporter pod SOS regulacijo Celice se na cepitev DNA z RGN odzovejo z ekspresijo SOS genov. Učinek so preverili z reporterskimi plazmidi pZA3LG, ki so imeli za promotorjem PL SOS genov sklopljen reporterski protein GFP. Uporabili so seve s plazmidno odpornostjo blaNDM-1 in kromosomsko gyrAD87G in bakteriofags s skladnimi RGN. V psimeru cepitve DNA se je sprožil mehanizem SOS in s tem ekspresija GFP. Večje izražanje GFP pri bakterijah z gyrAD87G je posledica lokacije na kromosomu, katere cepitev povzroči močnejši SOS odziv. Metoda ima potencial za uporabo v zaznavanju specifičnih genov ali sekvenc, tudi na nivoju posameznega nukleotida.

Vpliv toksin-antitoksin sistema na izzid episomalnega delovanja RGN

Cepitev na mestu tarčne sekvence, ki se nahaja na plazmidu, ima dva možna izzida. Lahko sproži citotoksičnost in apoptozo celice ali pa samo izgubo plazmida in s tem tudi izgubo odpornosti. Bakteriofag RGNndm-1 je v bakterijah, ki so imele plazmid z NDM-1 izoliran iz naravno odpornih celic, povzročil citotoksičnost, medtem ko je v bakterijah, ki so imele umetno konstruiran plazmid pZA-NDM-1-GFP, povzročil samo izgubo plazmida in s tem občutljivost na antibiotik. Citotoksičnost naravnih plazmidov je posledica toksin-antitoksin (TA) sistema, ki bakterijam omogoča ohranitev hčerinskih celic s plazmidom in smrt hčerinskih celic brez plazmida. TA sistem je sestavljen iz labilnega antitoksina, ki inhibira delovanje stabilnega toksina. Zaradi različne stabilnosti se po izgubi plazmida koncentracija antitoksina zmanjša hitreje kot toksina. Dominanca toksina povzroči citotoksičnost. Po sekvenciranju plazmida pSHV-18 so odkril prisotnost TA sistema pemIK. V bakterije s plazmidom pSHV-18 so dodali še plazmid z antitoksinom pZA31-pemI (antitoksin pemI in toksin PemK) in kontrolni vektor pZA31-GFP. Po transdukciji RGN z bakteriofagi v primeru z dodanim antitoksinom celice niso umrle, ampak so bile ponovno občutljive na antibiotik. PemI je inaktiviral PemK, kar je izgubo plazmida pSHV-18 brez citotoksičnosti. TA sistemi so odličilni na izzid bakteriofagne RGN aktivnosti na episomalne tarče.

Vpliv na populacijo bakterij z RGN

Probiotiki, prebiotiki in druga zdravila, ki vplivajo na človeški mikrobiom sicer ublažijo določena bolezenska stanja, vendar so njihovi stranski učinki in specifični mehanizmi delovanja slabo karakterizirani. Z RGN lahko specifično odstanimo bakterije z neželjenimi geni (rezistenca na antibiotike, virulenčni lokusi, vpliv na metabolne). Ustvarili so umetno populacijo treh sevov E.coli z odpornostjo na različne antibiotike. Sev EMG2 pNDM-1, ki nosi odpornost na B-laktamske antibiotike, sev RFS289 (mutacija DNA giraze D87G), ki nosi odpornost na kvinolon, in kontrolni sev CJ236 odporen na kloramfenikol. Z bakteriofagi RGNndm-1 so več kot 400-krat zmanjšali število bakterij EMG2 glede na kontrolni sev, z bakteriofagi RGNgyrAD87G pa so število bakterij RFS289 zmanjšali 20000-krat glede na kontrolni sev. RGN omogočajo selektivno uničenje bakterij s tarčno sekvenco DNA in s tem dominacijo netarčnih bakterij. In vivo bi to lahko dosegli z uporabo bakteriofagov, ki so dovzetni za širok nabor gostiteljev, mešanico bakteriofagov, konjugacijskimi plazmidi. Pristop je primeren tudi za študij bakterijskih populacij v povezavi z boleznimi.

Zaključek

Za CRISPR-Cas sistem, ki bo lahko deloval tudi na druge odporne seve, vključno z multi-odpornimi sevi, je potreben nadaljnji razvoj v izolaciji in optimizaciji. Potrebno bo tudi soočenje z razvojem fagnih dostavnih sistemov, ki imajo širok nabor gostiteljev, odpornostjo bakterij na bakteriofage in vpliv na imunski odziv.

Viri

Citorik RJ et al. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology, 32: 1141-1145, 2014.