Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov

FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing

Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje zapisov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.

Uvod

Zgradba TALEN-ov

TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL, ki so sekrecijski proteini pri bakterijah Xanthomonas. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Zadnja TALE-ponovitev je polovične dolžine. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov, ki se nahaja na C-koncu proteinov, izvira iz endonukleaze FokI.

Delovanje TALEN-ov

Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata zaporedje na DNA, ki ga TALEN prepozna in cepi. Nukleazna domena omogoča cepitev ene verige DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo verigo DNA tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Dvojni zlom DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi. Popravljanje lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ vodi do uvedbe delecij ali insercij, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.

Sinteza TALEN-ov

Načrtovanje TALEN-ov je enostavno, saj vsaka TALE-ponovitev prepozna 1 bazo na DNA. Za sintezo TALEN-ov se potrebne 4 osnovne TALE-ponovitve z različnimi variabilnimi dipeptidnimi motivi (NN prepozna gvanin, NI adenin, HD citozin in NG timin). Na aktivnost TALEN-ov vpliva več dejavnikov (npr. dolžine vmesnika med DNA-vezavno in nukleazno domeno, dolžine odseka DNA med obema FokI domenama, strukture FokI nukleazne domene, strukture C-končnega dela DNA-vezavne domene itd.).

Najtežja stopnja priprave TALEN-ov je sestavljanje zapisov za posamezno TALE-ponovitev v daljše konstrukte. Za ta korak obstaja več metod. Najstarejša temelji na standardnih tehnikah kloniranja, kjer kodirajoče zapise, ki so v vektorjih, med seboj združujemo preko restrikcij in ligacij. Sodobnejša različica je 'Golden Gate' kloniranje, ki omogoča vstavljanje do 10 TALE-ponovitev v vektor v enem koraku. Pri sestavljanju daljših konstruktov je potrebno pripraviti intermediarne vektorje. Slabost obeh metod je dolgotrajnost postopkov (nekaj tednov). Tretja skupina metod omogoča sintezo na trdnih nosilcih, kar pospeši potek dela in tako omogoči sintezo številnih TALEN-ov v kratkem času. K slednjim spada tudi metoda FLASH.

Uporaba metode FLASH za sestavljanje TALE-ponovitev

Metoda FLASH omogoča sestavljanje zapisov za TALE-ponovitve na trdnem nosilcu, ki ga predstavljajo magnetne kroglice s streptavidinsko prevleko. Ker so konstrukti tekom podaljševanja vezani na nosilec, so restrikcije, spiranja in ligacije med posameznimi stopnjami enostavne. Odcepljanje končnega DNA-kostrukta z nosilca temelji na restrikcijski reakciji, pri tem sproščen produkt pa že vsebuje ustrezne lepljive konce za vstavljanje v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov.

Za metodo FLASH potrebujemo arhiv 376-ih plazmidov, ki vsebujejo zapis za 1, 2, 3 ali 4 TALE-ponovitve v vseh možnih kombinacijah glede na dipeptidni motiv. Priprava arhiva se začne s pripravo plazmidov, ki vsebujejo zapis za eno TALE-ponovitev. Za vse plazmide je značilno, da je zapis za TALE-ponovitev na 5'-koncu podaljšan z unikatnima restrikcijskima mestoma XbaI in BbsI, na 3'-koncu pa z restrikcijskima mestoma BsaI in BamHI. To omogoča, da se po restrikciji z BbsI in BsaI z vektorja sprosti DNA-fragment s konci, ki omogočajo povezovanje zapisov za TALE-podenote. Tako lahko na enostaven način pripravimo vse možne dimerne, trimerne in tetramerne konstrukte in te ponovno vstavimo v primeren vektor. Potrebna je tudi priprava posebnih terminacijskih dimerov, ki se dodajajo v zadnjem koraku sestavljanja in imajo na 3'-koncu zaporedja spremenjeno restrikcijsko mesto, kar kasneje omogoča direktno vstavljanje končnega fragmenta v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov. Končni arhiv plazmidov vsebuje vektorje z zapisi za iniciacijsko podenoto (α), podaljševalne podenote (βγδε in βγ) in terminacijske podenote (β, βγδ, βγ* in δε*).

Pred potekom metode FLASH je potrebno DNA-fragmente pripraviti. Zapis za začetno monomerno podenoto je potrebno pomnožiti v PCR reakciji, kjer uporabimo biotiniliran smerni oligonukleotid. Produkt je na 5'-koncu biotiniliran fragment, ki ga nato cepimo z BsaI, pri čemer nastane na 3'-koncu značilen lepljiv konec. Ostale kasneje vstopajoče fragmente (zapisi za podaljševalne in terminacijski podenote) pripravimo z restrikcijo z BbsI, ki reže na 5'- koncu zapisov in BamHI, ki cepi za 3'-koncem zapisa, pri čemer se iz vektorja sprosti fragment z ustreznimi lepljivimi konci. Pri metodi FLASH v prvem koraku ligiramo na 5'-koncu biotiniliran zapis za začetno α podenoto in predhodno razrezan zapis za podaljševalno podenoto (βγδε). Po ligaciji se fragment pritrdi na s streptavidinom prevlečene magnetne kroglice, ki predstavljajo nosilec. Fragmente, ki so vezani na nosilec, režemo z BsaI, kar aktivira 3'-konce. Nato dodamo naslednji pripravljen zapis za podaljševalno podenoto in ligazo. Postopek nadaljujemo do željene dolžine fragmenta, v zadnji stopnji pa dodamo terminacijsko podenoto, ki ima na 3'-koncu modificirano restrikcijsko mesto. Sledi rezanje z BsaI, ki ustvari na 3'-koncu unikaten lepljiv konec in z BbsI, ki odcepi fragment z nosilca ter ustvari primeren 5'-konec za vstavljanje v ekspresijski vektor.

Raziskovalci so metodo FLASH avtomatizirali za delo na ploščah s 96 vdolbinami, kar pomeni, da lahko 1 delavec v 1 dnevu pripravi 96 različnih konstruktov.

Priprava ekspresijskih vektorjev za izražanje TALEN-ov

Konstrukt s TALE-ponovitvami je potrebno vnesti v ekspresijski vektor za izražanje TALEN-ov, ki smo ga predhodno rezali z restriktazo BsmBI. Ti vektorji so optimizirani za izražanje v sesalskih celicah in vsebujejo dodatne elemente TALEN-ov, ki so potrebni za nastanek funkcionalnega proteina. To so zapisi za N- in C-končni domeni iz proteina TALE13 (nahajata se levo in desno od inserta), zapis za končno polovično TALE-ponovitev in zapis za FokI domeno divjega tipa. Obstajajo 4 različni vektorji, ki vsebujejo različne polovične TALE- ponovitve. Vektor vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal, ki se po izražanju nahaja na N-koncu proteina in oznake FLAG.

Rezultati

Raziskovalci so z metodo FLASH sestavili večje število TALEN-ov in preverili njihovo učinkovitost na genih v liniji človeških celic U2OS.

Pripravili so ekspresijske plazmide za 48 parov TALEN-ov, ki ciljajo različna mesta znotraj EGFP gena v liniji človeških celic U2OS z EGFP reporterskim sistemom. Te celice imajo v genomu integrirano 1 kopijo gena EGFP, ki zapisuje za fluorescenčni protein. Kadar par TALEN-ov uvede zlom dvojne vijačnice, pride na mestu poškodbe do popravljanja z NHEJ in tako uvedbe mutacije, ki inaktivira gen EGFP. Izgubo fluorescence lahko kvantitativno določimo s pretočnim citometrom. Testirani TALEN-i so vsebovali različno število TALE-ponovitev (8,5 do 19,5), pri čemer sta bila TALEN-a istega para enako dolga. Vsi so ciljali kodirajoče zaporedje gena EGFP, kjer uvedba mutacije vodi do nefunkcionalnega proteina (znano iz predhodnih raziskav). Izgubo fluorescence EGFP so določili 2 in 5 dni po transfekciji celic s TALEN plazmidi. Ugotovili so, da vsi testirani TALEN-i povzročijo statistično relevantno izgubo fluorescence. Kratki (8,5 – 10,5 TALE-ponovitev) in dolgi TALEN-i (več kot 14,5 TALE-ponovitev) so približno enako učinkoviti, vendar so kratki za človeške celice bolj citotoksični. Citotoksičnost je najverjetneje posledica netarčnih učinkov, ki so pri kratkih TALEN-ih pogostejši.

V drugem delu eksperimenta so pripravili še ekspresijske plazmide za 96 parov TALEN-ov z zapisi za 14.5, 15.5 ali 16.5 TALE-ponovitev, ki ciljajo 96 različnih človeških genov, udeleženih pri raku (78 genov) ali epigenetski regulaciji (18 genov). TALEN-e so oblikovali tako, da cepijo v bližini N-konca protein-kodirajoče regije tarčnega gena. Večina preizkušenih parov TALEN-ov (84 od 96) je uvedla mutacijo znotraj izbranega gena. Do uvedbe je prišlo preko mehanizma NHEJ. Učinkovitost uvedbe mutacij je se je med posameznimi tarčnimi geni razlikovala in je variirala med 2,5 % do 55,8 %, kar so določili s T7EI testom. S sekvenciranjem so potrdili, da je prišlo do uvedbe mutacij (insercij in delecij) na pričakovanem mestu znotraj kodirajoče regije gena. Čeprav so se tarčna zaporedja med seboj razlikovala po vsebnosti posameznih baz, je 88 % izbranih parov TALEN-ov kazalo aktivnost. To nakazuje, da je območje tarčenja s tehnologijo TALEN skoraj neomejeno. Neaktivnost pri 12 % testiranih TALEN-ov je lahko posledica kompaktne strukture kromatina na določenih regijah, kar predstavlja sterične ovire za vezavo TALEN-ov.

Zaključek

S TALEN-i lahko urejamo genome pri različnih vrstah celic in organizmov. Metoda FLASH predstavlja pomemben korak k napredku tehnologije TALEN, saj omogoča hitro in avtomatizirano proizvodnjo TALEN-ov s poljubnim številom TALE-ponovitev. Testiranje velikega števila s FLASH metodo sestavljenih TALEN-ov kaže, da je delovanje TALEN-ov dokaj učinkovito ter da je nabor genov, ki jih s tehnologijo TALEN lahko naciljamo, praktično neomejen. V nadaljevanju bodo potrebne dodatne raziskave, predvsem na področju specifičnosti delovanja TALEN-ov.