Shramba fosfata

Povzeto po projektu iGEM skupine Manchester_2017

(Tadej Ulčnik)

1 Uvod

Fosfor je po masi šesti najbolj zastopan element v človeškem telesu, kar tudi priča o njegovi pomembnosti za delovanje celic. Najpogosteje se nahaja v obliki fosfata. Sestavlja ogrodje nukleinskih kislin, vsebujejo pa ga tudi energetsko bogate molekule, kot je npr. ATP. Anorganski fosfat se v največji meri uporablja kot dodatek umetnim gnojilom, saj spodbuja rast rastlin. Kmetijstvo, ki zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, tako vedno bolj troši zaloge fosfata, ki bi jih naj po ocenah bilo še le za okoli 50 do 100 let. Poleg pozitivne vloge fosfata, pa nastajajo v povezavi z njim tudi težave, saj se med drugim s polj spira v reke in tako povzroča bujno rast alg, kar neugodno vpliva na vodne ekosisteme. Velika količina fosfata se nahaja tudi v odpadnih vodah gospodinjstev.

Skupina iz univerze v Manchestru je videla rešitev tega problema v gensko spremenjenih bakterijah, ki bi bile sposobne iz vode privzeti fosfat in ga skladiščiti v visokih koncentracijah. S tem bi tako zmanjšale koncentracijo fosfata v vodi, prav tako pa bi bilo iz njih možno izolirati fosfat, s čimer se bi recikliral in lahko ponovno uporabil.

2 Načrtovanje bakterij

Osnovna ideja je bila, da bi bakterije bile sposobne polimerizirati fosfat do polifosfata ter ga skladiščiti. Za šasijo so si izbrali E. coli. Polimerizacijo fosfata omogoča encim polifosfat kinaza (PPK), s tem da na konec polifosfatne verige pripne fosfat iz ATP-ja (ob tem se odcepi ADP). Encimi eksofosfataze (PPX)pa odcepljajo fosfatne enote s polifosfata. Reštev problema delovanja eksofosfataz so videli v tvorbi mikrokompartmenta znotraj celice. Eksofosfataze ne bi mogle dostopati v notranjost, med tem ko bi bile polifosfat kinaze pritrjene z notranje strani, s čimer bi sinteza polifosfata potekala samo znotraj mikrokompartmenta.

Mikrokompartmente tvorijo številne bakterije z namenom shranjevanja in kopičenja molekul iz okolja ali pa molekul, ki jih sintetizirajo. So proteinske ovojnice, ki se sestavijo podobno kot virusna kapsida. Skupina se je odločila uporabiti mikrokompartment Eut (ethanolamine utilisation), ki je pri nekaterih bakterijah prisoten za shranjevanje etanolamina. Ta mikrokompartment sestavljajo proteini eutK, eutL, eutM, eutN in eutS. Naravno prisotna PPK iz E. coli ni dovolj aktivna za hitro in povišano polimerizacijo polifosfata, zato so uporabili PPK II iz Corynebacterium glutamicum, ki ima 30-krat večjo aktivnost. Da bi potekala sinteza polifosfata v notranjosti mikrokompartmenta, so morali zapisu za PPK dodati še N-terminalno zaporedje proteina PduD, s čimer se je konstrukt lahko vezal na proteine v notranjosti. Protein PduD je eden izmed proteinov mikrokompartmenta Pdu in sestavlja njegov notranji plašč, zato ima težnjo po vezavi v notranjost.

3 Rezultati

Najprej so preverili aktivnost in optimizirali sintezo konstruktov PPK. Pripravili so tri konstrukte (BBa_K2213003, BBa_K2213004 in BBa_K2213005) ki so vsebovali fuzijski protein z N-terminalno sekvenco PduD, PPK in 6xHis oznako. Od teh je bil v drugega in tretjega vstavljen še zapis za mCHERRY, s katerim so v naslednijh raziskavah preverjali uspešnost vezave PKK v mikrokompartment. Ugotovili so, da izmed teh dveh konstruktov pravilno nastane samo konstrukt BBa_K2213005, ki pa ima za okoli 80% nižjo aktivnost od divjega tipa PPK. V drugem delu so s spreminjanjem pogojev želeli ugotoviti optimalne pogoje za ekspresijo konstrukta BBa_K2213005. Količino proteina so določili preko merjenja fluorescence mCHERRY v celičnih lizatih. Najboljše rezultate so dobili, ko so po doseženi optični gostoti OD600 dodali IPTG dokončne koncentracije 1mM in stresali 48h pri 24°C.

Za sintezo mikrokompartmenta so pripravili tri konstrukte. Prvi (BBa_K2213000) je vseboval zapis za eutS pod kontrolo inducibilnega LacUV5 promotorja. Drugi (BBa_K2213001) je vseboval zapis za eutM in eutN pod kontrolo inducibilnega tetraciklinskega (tet) promotorja. Tretji (BBa_K2213002) je vseboval zapis za eutK in eutL pod kontrolo inducibilnega arabinoznega (araBAD) promotorja. Pri vseh konstruktih so dokazali, da se normalno poveča njihova koncentracija po dodatku indukturja.

Preverili so vpliv sinteze proteinov na rast celic z merjenjem optične gostote OD600. Ugotovili so, da se 20 ur po indukciji zmanjša število induciranih celic za med 67% do 81% v primerjavi z neinduciranimi celicami. Eut proteini so za celico najverjetneje toksični, zaradi česar bi bilo ugodneje celice najprej nagojiti in šele v končni fazi sprožiti indukcijo. V primeru kontinuirne kulture, kot so si jo zamislili, je pomembno najti ravnotežje med prirastom biomase (celic) in akumulacijo fosfata. Ko je koncentracija fosfatov nizka, bi morale celice usmeriti vso energijo v rast namesto v akumulacijo fosfata, saj ta predstavlja veliko energijsko breme.

Na podlagi tega so dizajnirali model operona, pri katerem bi povišana koncentracija fosfata inducirala sintezo eut proteinov, znižana pa jo reprimirala. Izhajali so iz pri E. coli in drugih bakterijah naravno prisotnega Pho regulona, ki pri njih igra glavno vlogo v regulaciji koncentracij anorganskega fosfata v celici. Spremenili so ga do te mere, da so namesto naravno prisotnih proteinov, ki regulirajo koncentracije fosfata, glavni produkt proteini eut, ki tvorijo mikrokompartment. Računalnška simulacija je pokazala, da bi se tak sistem odzval dosti hitro na spreminjajoče se koncentracije fosfata. Model se je izkazal za uspešnega, vendar pa ga zaradi preveliko dodatnega dela niso implementirali v njihov organizem.

Lokalizacijo PPK znotraj eut mikrokompartmenta so potrdili s fluorescenčno mikroskopijo. Kadar se je izražala samo PPK (katera je imela nase vezan fluorescenčni protein mCHERRY), se je ta razporedila po celotni celici. Šele ko so inducirali sintezo vseh petih eut proteinov se je fluorescenca skoncentrirala v točki, kjer je nastal mikrokompartment. V primeru da se kateri izmed eut proteinov ni izražal, ni prišlo do pojava fluorescenčne točke. Potrebno je bilo še dokazati prisotnost polifosfata v mikrokompartmentu. Za to so uporabili barvilo DAPI, ki se veže na polifosfat. Z fluorescenčno mikroskopijo so potrdili kolokalizacijo modre (DAPI) in rdeče (mCHERRY) barve, kar je pomenilo, da se polifosfat in PKK nahajata v mikrokompartmentu.

4 Poslovni načrt

Skupina se je najprej odločila, da bi naredila produkt, ki bi bil uporaben za akumulacijo fosfata iz odpadnih voda. Povezali so se z večimi strokovnjaki iz področja čiščenja voda, ter s čistilno napravo Davyhulme Treatment Works iz Manchestra. Pridobili so podatke o količini fosfata v odpadni vodi, ki jo čistilna naprava prejme. Preko tega so lahko izračunali okvirne enoletne stroške gojenja bakterij, ki bi bile sposobne akumulirati ves fosfat iz vode. Načrtovali so, da bi pripravili kontinuirno celično kulturo v 10l termostatu. Tak način gojenja bakterij bi po njihovih izračunih zahteval 0,76$ za pridobljenega 7,3g fosfata iz odpadne vode. Če bi na ta način želeli odstraniti ves fosfat iz odpadne vode v Manchestru, bi letno porabili okoli 550 milijonov funtov. Kg pridobljenega fosfata na ta način bi stal več kot 100$, med tem ko je trenutna cena na trgu zanj med 0,10$ in 0,50$ na kilogram. Predlagali so več rešitev kako bi prihranili stroške, kot so naprimer zamenjava glukoze z glicerolom, menjava šasije, gojenje celic direktno v odpadni vodi ter prodaja recikliranega fosfata. V nobenem primeru niso mogli zmanjšati stroškov do te mere, da bi dobili tržno ugoden produkt.

Drugi načrt je bil pripraviti sistem za akumulacijo fosfata iz vode, ki jo uporabijo gospodinjski aparati (pralni stroj, pomivalni stroj). Vir fosfata v tej vodi so čistilna sredstva. Tu so morali najprej preveriti termostabilnost na novo uvedenih proteinov, saj ima v tem primeru odpadna voda višjo temperaturo kot v čistilni napravi. Izkazalo se je, da je več konstruktov PPK najbolj stabilnih okoli 30°C, potem pa stabilnost hitro pada, zaradi česar je tak sistem neuporaben v vodi, ki lahko presega tudi 50 °C.

5 Zaključek

Skupina je želela pripraviti E. coli, ki bo sposobna iz vode akumulirati in sladiščiti fosfat. To jim je z uvedbo zapisov za 5 eut proteinov, ki tvorijo mikrokompartment za shranjevanje fosfata, ter fuzijskim proteinom PPK, ki sintetizira polifosfat uspelo. Uspelo jim je ustvariti produkt, ki pa ga žal na današnjem trgu ne bi bilo mogoče prodati, saj se zaradi dokaj nizkih cen fosfata njegova akumulacija na ta način ne izplača. Kljub temu so predlagali veliko teoretičnih izboljšav, ki pa jih zaradi pomanjkanja časa niso uspeli izpeljati.