Sintezna biologija naravnih produktov (nitastih) gliv

Uvod

Nitaste glive spadajo v skupino evkariontskih heterotrofnih mikroorganizmov, ki pridobivajo energijo z oksidacijo organskih spojin. Rastejo v obliki razvejanih niti (hife) dolžine med 2 μm in 18 μm. Najbolj poznane nitaste glive so iz rodu Aspergillus in Penicillium.

Uporabnost nitastih gliv je prvi opazil Alexander Fleming leta 1928 z odkritjem penicilina. To je bil prvi odkriti naravni produkt (NP) nitastih gliv. NP so po večini sekundarni metaboliti, ki se sintetizirajo kot odgovor na signale iz okolice. Znanstveniki ocenjujejo, da trenutno poznamo 6 % vseh NP nitastih gliv uporabnih v farmaciji, medicini in živilski tehnologiji. Mednje sodijo antibiotiki (ampicilini, cefalosporini, aminoglikozidi, tetraciklini in drugi poliketidi), zaviralci imunskega sistema (ciklosporini, rapamicin), zniževalci ravni holesterola (mevastatin in lovastatin) ter antitumorski antibiotiki (antraciklin, belomicin, mitomicin, paklitaksel, vinblastin). Poleg tega predstavljajo nitaste glive tudi vir različnih encimov npr. amilaze, amiloglukozidaze, celulaze, pektinaze, proteaze, lipaze, glukoza oksidaze.

Predvsem zmožnost bakterij, da pridobijo rezistenco na do sedaj znane antibiotike in želja po novih, bolj učinkovitih zdravilih znanstvenike spodbuja k raziskovanju nitastih gliv kot vir novih NP. V ta namen si znanstveniki prizadevajo bolje razumeti proizvodnjo sekundarnih metabolitov, njihovo regulacijo in možnost za kontrolo proizvodnje želenega NP. Metode sintezne biologije na tem področju omogočajo:
• manipulacijo regulatornih elementov za sintezo novih NP
• heterologno ekspresijo biosinteznih poti NP
• inženiring različnih multidomenskih encimov v bioloških poteh sinteze NP

Manipulacija regulatornih elementov

Z genomskimi orodji so znanstveniki odkrili gruče genov, ki omogočajo sintezo NP. Ugotovili so, da je lahko v enem organizmu tudi do 80 takih gruč genov. Ker v normalnih pogojih večina sekundarnih metabolitev ni sintetiziranih se za proizvodnjo že znanih in odkrivanje novih NP poslužujejo različnih metod za aktivacijo gruč genov.

Prvi primeri so temeljili na manipulaciji globalnih aktivatorjev LaeA ali VelA.

Za uravnavanje nivoja izražanja gruč genov se lahko uporabi tudi različne promotorje:
• konstitutivni– gpdA (gliceralaldehid-3-fosfat dehidrogenaza) otef
• inducibilni – alcA –(alkohol dehidrogenaza), pXyl (ksilozni) in tetraciklinski promotorski sistem.

Zanimiva regulacija aktivacije gruč genov je tudi kokultivacija z drugimi organizmi. Preučena sta bila primera kokultivacije bakterije Streptomyces rapamycimus z nitastima glivama Aspergillus nidulans in Aspergillus fumigatiens. V obeh primerih je prišlo do aktivacije gruč genov ter s tem produkcije novih NP.

Nadaljnje raziskave so pokazale, da pri omenjeni kokultivaciji bakterija aktivira glivno histon acetiltransferazo (HAT), ki aktivira prepis gruče genov. Raziskovalci so nadaljnje ugotovili, da lahko z mutacijami histona H3, ki posnemajo acetilacijo oziroma deacetilacijo reguliramo aktivacijo in inaktivacijo gruče genov.

Sintezo NP lahko optimitziramo tudi na nivoju lokalizacije molekul v celici. Zgodnje študije trostopenjske sinteze penicilna so pokazale, da prvi dve reakciji potekata v citosolu, zadnja pa v peroksisomu. Povečanje števila peroksisomov ter lokalizacija drugih proteinov biosintezne poti penicilina v peroksisom je pokazalo zvišano produkcijo penicilina. Z omejitvijo biosintezne poti na določen celični organel pripomoremo k zadrževanju prekurzorjev in encimov v zaprtih, kontroliranih organelih, kar poveča produkcijo končnega produkta.

Heterologni ekspresijski sistemi

Heterologna ekspresija omogoča preučevanje glivnih encimov in bioloških poti v drugih organizmh. Prav tako lahko s heterologo ekspresijo določimo uporabnost nitastih gliv kot heterolognih sistemov za izražanje tujih genov.

Za izražanje NP nitastih gliv, ki jih ne znamo gojiti se lahko uporablja heterologno izražanje v industrijskih sevih nitastih gliv, npr. A. niger. Če uporabimo organizem, ki ima tudi lastno proizvodnjo NP je večja verjetnost, da se bo uspešno proizvajal tudi heterologni NP. Vendar lahko zaradi organizmu lastnih NP pride do problemov z detekcijo heterolognega NP. Rešitev problema je izražanje heterolognih NP v A. nidalus, prilagojenim z izbitjem gruč genov, ki so privedli do visoke produkcije lastnih NP. S tem so dobili “čisto ozadje” za enostavno detekcijo heterolognih NP.

Veliko možnosti za izražanje genov filamentoznih gliv pa predstavljajo tudi že znani in dobro raziskani mikroorganizmi za heterologno produkcijo. Med dosedanjimi raziskavami izstopa kvasovka Pichia pastoris, ki je znana po visoki produktivnosti heterolognih proteinov. V poskusu s koekspresiranima sintazo 6-metilsalicilne kisline (poliketid sintaza) iz A. terreus in fosfopantetil transferazo (PPTaza) iz A. nidalus je prišlo do sinteze 2,2 g/L 6-metilsalicilne kisline, kar je do sedaj največja poročana proizvodnja.

Mnoga raziskovanja se usmerijajo tudi v optimizacijo kvasovke Saharomyces cerevisiae za porizvodnjo obstoječih in raziskavo novih naravnih produktov nitastih gliv. Kvasovka ne proizvaja lastnih NP, zato zaznavanje NP ne predstavlja večjega problema. Vendar je to hkrati tudi slabost, saj nima potrebnih genov poliketid sintaz (PKS) in fosfopantetiltransferaz (PPTs) za sntezo NP.

Inženiring proteinov v biosintezni poti NP

Razumevanje biosintezne poti nastanka različnih NP znanstvenikom še vedno predstavlja izziv. Glavna encima v biosintezni poti NP sta multidomenske poliketid sintaze (PKS) in ne-ribosomalne peptid sintetaze (NRPS).

Pri nekaterih nitastih glivah v biosintezni poti nastopa tip 1 PKS podobne sintaze (type 1-like PSK), ki ciklično opravljajo določen korak v biosintezni poti. Dosedanje raziskave še niso uspele odkriti regulacije števila ciklov, zato je težko napovedati kateri poliketidni produkt bo nastal.

Poleg PSK, ki naredijo ogrodje produkta za sintezo potrebujemo tudi pomožne encime (npr. Citokrom P450), ki molekuo modificirajo. S tem pride do nastanka ter specifičnega sproščanja končnega produkta. Raziskovanja delovanja encimov v biosintezni poti NP so privedla do odkritja novih domen: začetna enota acil transacilaze (ang.: starter unit acyl transacylase, SAT) in domena predloge produkta (ang.: product template domain, PT) v ne-reducirajočih poliketid sintazah (NR-PKS). Zanimive so tudi visoko-reducirajoče poliketid sintaze (HR-PKS), ki imajo različne načine redukcije, kar privede do velike kemijske diverzitete produktov.

Z metodo zamenjave domen iz različnih nitastih gliv so znanstveniki uspeli pridobiti nove naravne produkte in s tem predstavili neskončne možnosti za sintezo bioaktivnih spojin.

Zaključek

Potreba po sekundarnih metabolitih, ki se uporabljajo v farmaciji in medicini je čedalje večja. Zato se velik del raziskav usmerja v proizvajalce naravnih produktov, s čimer odkrivajo neskončni potencial nitastih gliv za proizvodnjo novih NP. Znanstveniki z metodami sintezne biologije poskušajo razložiti in bolje razumeti biosintezno pot proizvodnje NP. Sintezna biologija jim omogoča enostavno regulacijo izražanja gruč genov, vpletenih v sintezo NP; heterologno izražanje biosinteznih poti iz različnih nitastih gliv v zelo dobro poznanih evkariontskih modelnih organizmih ter spreminjanje encimov, ki sodelujejo v sintezi NP za bolj produktivno proizvodnjo ali sintezo novih NP.

Viri

Mattern, D. J., Valiante, V., Unkles, S. E. & Brakhage, A. a. Synthetic Biology of Fungal Natural Products. Front. Microbiol. 6, 1–7 (2015).
Cragg, G. M. & Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 1830, 3670–3695 (2013).
Ward, O. P. Production of recombinant proteins by filamentous fungi. Biotechnol. Adv. 30, 1119–1139 (2012).
Krivoruchko, A. & Nielsen, J. Production of natural products through metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Curr. Opin. Biotechnol. 35, 7–15 (2015).
Netzker, T. idr. Microbial communication leading to the activation of silent fungal secondary metabolite gene clusters. Front. Microbiol. 6, 1–13 (2015).