SnoRNA pri človeku in njihova vloga pri razvoju bolezni

Uvod

Raziskave na področju molekularne biologije RNA so v zadnjih letih pokazale izrazito raznolikost zvrsti in funkcij različnih RNA molekul, ki presegajo meje centralne dogme. Tako imenovane nekodirajoče RNA so odgovorne za vrsto celičnih procesov; od vpliva na izražanje genov do najrazličnejših katalitskih aktivnosti. Med nekodirajoče RNA sodijo tudi male jedrčne RNA oziroma snoRNA, ki omogočajo usmerjene modifikacije drugih RNA molekul in so ključne v procesih zorenja rRNA in s tem produkcije ribosomov, hkrati pa vodijo tudi modifikacije na snRNA ter tako posledično vplivajo na procesiranje mRNA.

Biogeneza in struktura snoRNA

Večina snoRNA nastane tekom procesiranja drugih RNA molekul, predvsem iz izrezanih intronskih regij mRNA. Po izrezovanju se sproščena lariatna struktura razvije s pomočjo posebnih klestilnih encimov nato pa ekso- in endonukleaze prekurzorsko snoRNA skrajšajo do svoje končne oblike. Obstajajo pa tudi nekatere snoRNA, ki so v genomu prisotne kar pod svojim lastnim promotorjem. Nastali transkript takih snoRNA se od navadnih mRNA molekul razlikuje predvsem zaradi odsotnosti poli-A-repa ter po posebni 5'-kapi (2,2,7-trimetilgvanozinska – TMG kapa). Te razlike so ključne, saj se tako snoRNA ne prenese v citoplazmo, kot je to značilno za mRNA molekule, temveč ostane v jedru, kjer lahko opravlja svoje funkcije.

V splošnem snoRNA delimo na dve skupini: C/D snoRNA in H/ACA snoRNA. Obe skupini izkazujeta visok nivo ohranjenosti, kar priča o pomembnosti funkcij, ki jih opravljata. C/D snoRNA so namreč ključnega pomena pri 2'-O-metilaciji nukleotidov, H/ACA snoRNA pa so potrebne za psevdouridilacijo – izomerizacijo uridina v psevdouridin.

C/D snoRNA

C/D snoRNA vsebujejo dve ponovitvi C- (RUGAUGA) in D-škatle (CUGA), ki se preko parjenja baz in asociacije proteinov povežejo v obliko lasnične zanke z večjo notranjo vezavno zanko. C/D snoRNA karakteristično vežejo štiri proteine: Nop56, Nop58, 15.5K (imenovan tudi snu13p) in fibrilarin (FBL), ki katalizira metilacijo na tarčni RNA molekuli. Slednja se veže v notranjo zanko nastalega snoRNP kompleksa, ki jo sestavljata elementa komplementarna tarčnemu zaporedju, zaslužna za usmerjanje in specifičnost delovanja.

H/ACA snoRNA

H/ACA snoRNA ima značilno strukturo iz dveh lasničnih zank, vsaka prav tako z dodatno notranjo zanko. Škatla H (ANANNA) se nahaja na koncu prve, škatla ACA pa na koncu druge lasnične zanke. Tovrstne snoRNA asociirajo z raznimi strukturnimi proteini kot so NhP2, Nop10 in GAR1 ter diskerinom, ki ima psevdouridin sintazno aktivnost. Tarčna molekula RNA se veže v notranje zanke snoRNA, ki tako omogočajo, da modifikacije potečejo na ustreznih mestih. Nekateri H/ACA snoRNP nosijo tudi drugačne katalitske funkcije, kot sta denimo 2'-O-metilacija in N4-acetilacija citidina (ac4C), ki sta prav tako ključni za zorenje rRNA in nastanek novih ribosomov. Seveda morajo takšne snoRNP sestavljati drugi proteini, specializirani za določeno funkcijo.

sdRNA

Vredno je poudariti tudi dejstvo, da snoRNA niso vedno končna stopnja biogeneze. Več kot polovica vseh znanih snoRNA namreč vstopi v nadaljnje faze procesiranja, v katerih iz večje molekule nastane več manjših fragmentov imenovanih sdRNA (angl. snoRNA-derived RNAs). Čeprav gre velikokrat zgolj za produkte razgradnje, se ohranjenost in stabilizacija določenih sdRNA ponuja kot dokaz o morebitni vlogi v celičnih procesih. Poleg tega raziskave kažejo na izrazite razlike v vzorcih izražanja sdRNA, ki se pojavijo med zdravimi in rakavimi celicami. Za odgovor na vprašanja, ali so te deviacije zgolj indikator rakavega stanja celice ali gre za enega ključnih faktorjev razvoja raka, pa je potrebnih še mnogo dodatnih preiskav.

Pomen snoRNA pri različnih obolenjih

Akutna mieloična levkemija

Hematopoeza je proces tvorbe krvnih celic, ki v večji meri poteka v kostnem mozgu. Hemocitoblasti, krvotvorne matične celice, morajo imeti uravnoteženo sposobnost obnavljanja in diferenciacije v različne tipe krvnih celic. V kolikor se pojavijo motnje v teh dveh procesih, lahko pride do nastanka različnih rakavih obolenj, kot je na primer akutna mieloična levkemija (AML). Pri AML pride do abnormalne proliferacije in diferenciacije v bele krvničke, ki se nato kopičijo v kostnem mozgu in s tem ovirajo tvorbo drugih krvnih celic.

Pri normalni tvorbi krvnih celic snoRNA regulirajo modifikacije rRNA, še posebej 2'-O-metilacijo in psevdouridilacijo. Te so ključne za pravilno zvitje in delovanje ribosomov ter s tem produkcijo proteinov, ki regulirajo nasprotujoča si procesa obnavljanja in diferenciacije hemocitoblastov. Raven izražanja snoRNA je največja v hemacitoblastih in hitro upade tekom diferenciacije v granulocite in limfocite. Pri AML pa je izražanje snoRNA pogosto slabo regulirano. Nekatere snoRNA so tudi funkcijsko spremenjene, kar dodatno prispeva k nastanku levkocitov in zaviranju apoptoze. Obstajajo trije različni mehanizmi, kako snoRNA prispeva k razvoju AML.

Eden izmed pomembnejših H/ACA snoRNA je SNORA21, ki običajno vodi psevdouridilacijo rRNA. Pri AML pride do izgube te snoRNA. Sinteza ribosomov je torej ovirana, s tem pa se spremeni tudi translacija regulatornih proteinov, kar pripelje do povečane celične proliferacije in nastanka rakavega tkiva.

Drugi način vključuje translokacijo regije q22 kromosoma 8 na kromosom 21. Posledično pride do tvorbe onkogenega proteina AML1-ETO. Ta protein skupaj z AES (angl. amino terminal enhancer of split) inducira tvorbo snoRNP. Z njegovo pomočjo AML1-ETO interagira z RNA-helikazo DDX2. Tvorba kompleksa AML1-ETO, snoRNP in DDX2 pa povzroči izdatno povišano izražanje onkogenih proteinov, hkrati pa zavira produkcijo tumorsupresorjev.

Pri približno tretjini bolnikov z AML pa pride do spremembe bralnega okvira na genu za nukleofozmin 1 (NPM1 oziroma B23). Ta povzroči, da se NPM1 ne nahaja več v jedru, temveč v citosolu. Pri tem se zgodi sprememba tako procesiranja mRNA kot tudi izgradnje ribosomskih podenot, ker zaradi odsotnosti NPM1 C/D snoRNP ne morejo modificirati substratne mRNA in rRNA, kar privede do sprememb v celičnih procesih.

Nevrodegenerativne bolezni

Poleg vloge pri tvorbi raka, so snoRNA pomembne tudi pri patologiji različnih nevrodegenerativnih bolezni. Pri Prader-Willijevem sindromu (PWS) gre za delecijo predela očetovih genov kromosoma 15, ki zapisuje za dve C/D snoRNA; SNORD115 in SNORD116. SNORD115 večinoma obstaja v skrajšani obliki B, ki vsebuje zgolj eno C- in D-škatlo, ki obdajata protismerno zaporedje. Takšne skrajšane oblike, imenovane psnoRNA ne tvorijo lasničnih zank, ki so pomembne za vezavo klasičnih snoRNP proteinov, temveč delujejo kot miRNA in se s svojo protismerno regijo vežejo na ustrezno mRNA in tako vplivajo na njeno procesiranje. Izvajanje poskusov na miših je pokazalo, da izbris SNORD115 povzroči nepravilno izrezovanje intronov pre-mRNA serotonin 2C receptorja, katerega napačna zgradba naj bi povzročala vedenjske in prebavne motnje. Izbris SNORD116 pa povzroči velike spremembe pri razvoju možganov zaradi motene metilacije mRNA, ki je povezana tudi s povišano telesno težo, prebavnimi motnjami in spremembami cirkadianega ritma. Poleg PWS pa imata SNORD115 in SNORD116 vplive tudi pri Alzheimerjevi bolezni. SNORD115 naj bi reguliral sintezo peptida amiloida beta in τ-proteina, ki sta ključna faktorja pri Alzheimerjevi bolezni.

Odzivi na homeostatski stres

Presnovni stres nastopi, ko celica porablja več energije in substratov, kot jih ima na voljo. Značilen primer je lipotoksičnost, ki jo med drugim povzroča presežek nasičenih maščobnih kislin, kar vodi do poškodb endoplazemskega retikuluma in mitohondrijev. To privede do zmanjšanja sinteze ATP, poveča pa se količina reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) in pojavi se oksidativni stres, kar privede do nastajanja pro-vnetnih citokinov ter prispeva k programirani celični smrti.

Tradicionalno snoRNA delujejo v jedrcu, kjer omogočajo modifikacije ribosomske RNA, a so novejše raziskave pokazale, da imajo nekatere tudi zunajjedrno funkcijo. Pomemben primer so C/D snoRNA, kodirane znotraj Rpl13a lokusa. Pri pogojih presnovnega stresa lahko ti preidejo v citoplazmo, kjer sodelujejo pri nadzoru rasti in metabolizma. Pomembni pa so tudi pri odzivu na presnovni stres. Ob povišani lipotoksičnosti se te snoRNA transportirajo iz jedrca v citoplazmo, kjer vplivajo na funkcionalnost mitohondrijev, kopičenje reaktivnih kisikovih zvrsti in homeostazo glukoze. Celice brez teh snoRNA so v poskusih kazale večjo odpornost na oksidativni stres in povečano izločanje inzulina ob prisotnosti glukoze.

Tudi SNORA73A in SNORA73B imata pomembno vlogo pri uravnavanju metabolizma. Delujeta na način, da zavirata mTOR signalizacijo, s čimer celico usmerjata v metabolno bolj varčen način in tako zmanjšujeta poškodbe jeter v pogojih steatohepatitisa – bolezni, povezane z akumulacijo lipidov in vnetjem jeter.

Te ugotovitve jasno kažejo, da imajo snoRNA aktivno funkcijo tudi v citoplazmi, še posebej ob presnovnih obremenitvah. Njihovo delovanje je odvisno od celičnega okolja, kar odpira pomembna vprašanja za prihodnje terapevtske pristope.

snoRNA kot terapevtske tarče

Raziskave kažejo, da spremembe v izražanju snoRNA niso povezane le s presnovnimi motnjami, ampak tudi s številnimi drugimi boleznimi, vključno z rakom in degenerativnimi boleznimi skeleta. Ugotovili so, da sta SNORA71A in SNORA72 pogosto prekomerno izražena v rakavih celicah, na primer pri raku pljuč in raku jajčnikov. Njuna inhibicija povzroči ustavitev celičnega cikla, zmanjša migracijo celic in zavira samoobnavljanje tumorskih celic. Prav tako pri pljučnem raku zmanjšuje celično rast utišanje SNORA42. SNORD52 pa v sodelovanju z drugimi proteini spodbuja razvoj hepatocelularnega karcinoma, kar bi lahko potencialno zdravili s tarčenjem interakcij v tej signalni poti. Podobne učinke, ki bodisi pospešujejo ali zmanjšujejo rast tumorjev pa imajo tudi druge snoRNA.

Poleg vpliva pri rakavih obolenjih imajo snoRNA pomembne vloge tudi pri drugih celičnih procesih, na primer homeostazi holesterola (SNORA73) in presnovi lipidov (SNORD60). SnoRNA lahko vplivajo tudi na formacijo tRNA-fragmentov s preprečevanjem njenega cepljenja. Primer tega je SNORD113-6, ki tRNA pred fragmentacijo zaščiti z metilacijo, kar ima pomembno vlogo pri ohranjanju stabilnosti strukture žil. Ker pri boleznih srca in ožilja pogosto pride do preoblikovanja zgradbe žil, bi lahko s povečanjem stabilnosti SNORD113-6 zvišali nivo metilacije tRNA. To bi lahko dosegli denimo z uporabo protismernega zaporedja, ki zaščiti njegov 3'-konec, ali pa s pomočjo siRNA, kar ponuja nove možnosti zdravljenja.

snoRNA kot molekularni stroji

Poleg svoje vloge v odzivu na stres in presnovi imajo snoRNA še sposobnost natančne regulacije celičnih procesov, na podoben način kot sistemi, ki jih poznamo pri tehnologijah CRISPR-Cas9. SNORD50A na primer regulira izražanje genov tako, da blokira procesiranje mRNA na poliadenilacijskih mestih. Podobno pa SNORA14A vpliva na celični cikel: njeno povečano izražanje povzroči zastoje v G2/M fazi celičnega cikla in spodbuja apoptozo. Tovrstni snoRNA imajo tako tumorsupresorsko funkcijo.

SNORD76 in SNORD44 sta v normalnih celicah visoko izražena, v glioblastomu ali raku dojke pa je njuna izraženost zmanjšana. Reaktivacija teh genov v tumorskih celicah zmanjša proliferacijo in spodbuja celično smrt, kar nakazuje, da bi snoRNA lahko uporabili kot molekularna orodja za nadzor rasti tumorjev.

Zaključek

snoRNA v celici opravljajo veliko biološko pomembnih funkcij. Ena pomembnejših je usmerjanje posttranskripcijskih modifikacij na substratnih RNA molekulah, nekatere snoRNA pa so sposobne tudi regulacije translacije po analogiji z miRNA. Svojo vlogo imajo pri mnogih različnih patoloških stanjih, kjer lahko bodisi promovirajo bodisi zavirajo razvoj bolezni. Posledično lahko z vplivi na snoRNA manipuliramo izbrane celične procese, kar ponuja nove terapevtske pristope. Za razvoj učinkovitih metod pa je potrebnih še mnogo nadaljnjih raziskav, ki bodo podale odgovore na do sedaj še neznana vprašanja.

Viri

• Chauhan, W., Sudharshan, Sj., Kafle, S., Zennadi, R. SnoRNAs: Exploring Their Implication in Human Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 2024; 25(13):7202. https://doi.org/10.3390/ijms25137202.
• Huang, Zh., Du, Yp., Wen, Jt. et al. snoRNAs: functions and mechanisms in biological processes, and roles in tumor pathophysiology. Cell Death Discov. 8, 259 (2022). https://doi.org/10.1038/s41420-022-01056-8.
• Kishore, S., Khanna, A., Zhang, Z., Hui, J., Balwierz, P. J., Stefan, M., Beach, C., Nicholls, R. D., Zavolan, M., Stamm, S. The snoRNA MBII-52 (SNORD 115) is processed into smaller RNAs and regulates alternative splicing. Human Molecular Genetics, Volume 19, Issue 7, 1 April 2010, Pages 1153–1164. https://doi.org/10.1093/hmg/ddp585.
• van Ingen, E., Engbers, P. A. M., Woudenberg, T., van der Bent, M. L., Mei, H., Wojta, J., Quax, P. H. A., Nossent, A. Y. C/D box snoRNA SNORD113-6 guides 2'-O-methylation and protects against site-specific fragmentation of tRNALeu(TAA) in vascular remodeling. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2022 Sep 17;30:162-172. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.09.011.