Solni trezor

Povzeto po projektu iGEM skupine iz Aachna.

(Tomaž Žagar)

1 Uvod

Industrijske odpadne vode lahko vsebujejo velike količine raztopljenih soli, ki pri izlitju v reke povzročijo njihovo zasoljevanje in vplivajo na rečni ekosistem. Namen projekta Solni trezor je bil najti sinteznobiološko rešitev za razsoljevanje odpadnih voda pred izpustom v okolje.

Solni trezor so gensko spremenjene kvasovke Saccharomyces cerevisiae, ki so modificirane z namenom, da privzamejo čim več soli (NaCl) in jo akumulirajo znotraj celice ter tako zmanjšajo količino soli v odpadni vodi. Potem ko kvasovke iz vode odstranijo sol, jih je možno enostavno odfiltrirati. Ker je prevelika koncentracija soli v citosolu toksična, je bilo potrebno uporabiti organizem, ki ima organele, v katerih bi se le-ta lahko kopičila. To je bil poglavitni razlog, da so kot šasijo izbrali kvasovko, saj lahko za razliko od bakterij sol kopiči v vakuoli in predvakuolarnih kompartmentih.

Pri oblikovanju Solnega Trezorja so spreminjali kvasovkine mehanizme, ki so odgovorni za toleranco na sol, dodatno pa vključili še mehanizme iz rastline Arabidopsis thaliana.

2 Kvasovkini mehanizmi tolerance na sol

Na povišano citosolno koncentracijo NaCl se kvasovka odzove z dvema sistemoma. Prvi sistem temelji na črpanju natrijevih ionov iz celice, za kar sta odgovorna transporterja ENA1 in NHA1. ENA1 je Na+-ATPaza, ki črpanje natrija iz celice sklopi s hidrolizo ATP, NHA1 pa je Na+/H+-antiporter, ki izloča natrij iz celice z izrabo protonskega gradienta preko plazemske membrane. Drugi sistem pa temelji na sekvestraciji natrija v predvakuolarnih kompartmentih, za kar je odgovoren protein NHX1, ki je tudi Na+/H+-antiporter in se nahaja v membranah predvakuolarnih kompartmentov. Tako kot NHA1 tudi NHX1 za črpanje natrija izrablja protonski gradient preko membrane. Natriju zaradi težnje po elektronevtralnosti sledi klorid, ki prehaja skozi kloridne kanalčke, kot je GEF1.

3 Genske modifikacije kvasovk za pripravo Solnega trezorja

Namen Solnega trezorja je akumulirati čim več soli znotraj celice v predvakuolarnih kompertmentih in vakuoli. Da bi pripravili čim bolj učinkovit sistem, so ustvarili več gensko spremenjenih kvasovk, v katere so posamično in v različnih kombinacijah vstavljali, izbijali in prekomerno izražali različne gene. Glede na učinek lahko te genske spremembe razdelimo v tri skupine:

1) Izbitje genov za transporterja, ki črpata natrij iz celice (ENA1 in NHA1), s čimer so dosegli, da je čim več natrija ostalo v citosolu.

2) Prekomerno izražanje proteina NHX1, s čimer so povečali akumulacijo natrija v predvakuolarnih kompartmentih.

3) Vstavljanje dveh genov iz rastline Arabidopsis thaliana, s pomočjo katerih se sol sekvestrira v vakuoli. Gena iz Arabidopsis thaliane so uporabili, ker je to na sol tolerantna rastlina, ki toleranco doseže s sekvestracijo soli v vakuoli, kar v kvasovki ni primarni mehanizem. Ta dva gena zapisujeta za proteina AtNHXS1 (optimiziran vakuolarni Na+/H+-antiporter) in AVP1 (H+-pirofosfataza). AtNHXS1 za transport natrija proti koncentracijskemu gradientu izrablja protonski gradient preko vakuolarne membrane, AVP1 pa ta protonski gradient ustvarja oz. povečuje – hidrolizo pirofosfata sklopi s črpanjem protonov v vakuolo.

V projektu so se posvetili Solnemu trezorju, ki akumulira natrij, vendar bi v teoriji lahko pripravili gensko spremenjene kvasovke, ki akumulirajo poljubne ione. Za prikaz prilagodljivosti koncepta so pripravili mutanto NAKT, ki akumulira kalij, in sicer z integracijo K+-ATPaze AtAKT1 iz rastline Arabidopsis thaliana v kvasovko, ki je že imela izbita gena za transporterja ENA1 in NHA1 (poleg natrija izven celice v manjši meri črpata tudi kalij).

4 Potek priprave Solnega trezorja

Priprava gensko spremenjenih kvasovk je temeljila na homologni rekombinaciji. Z reakcijo PCR so najprej pomnožili posamezne fragmente konstruktov in jim dodali homologne konce, te fragmente pa potem transformirali v kvasovke. V celici je s pomočjo rekombinacijskih encimov prišlo do združevanja fragmentov in njihove integracije v tarčno mesto na genomu, ki je bilo določeno s homolognimi regijami na koncih konstruktov.

Za prekomerno izražanje transporterja NHX1 in vstavljanje transporterjev iz rastline Arabidopis thaliana (AtNHXS1 in AVP1) so uporabili konstrukte, ki so bili iz 5'- proti 3'-koncu sestavljeni iz zgornje homologne regije, promotorja GAL1, vstavljenega gena, terminatorja TCYC1 oz. TADH1, loxP mesta, avksotrofnega markerja (HIS3, LEU2 oz. URA3), loxP mesta in spodnje homologne regije. Pri izvajanju izbitja genov za transporterja ENA1 in NHA1 so uporabili delecijsko kaseto KanMX, ki je bila iz 5'-konca proti 3'-koncu sestavljena iz zgornje homologne regije, promotorja TEF, gena za odpornost na kanamicin (KanR), terminatorja TEF in spodnje homologne regije. Po transformaciji in homologni rekombinaciji fragmentov ter selekciji mutant na avksotrofnem gojišču (mutante, ki so sprejele avksotrofni marker) oz. gojišču z geneticinom (mutante, ki so sprejele delecijsko kaseto KanMX) so z reakcijo PCR preverili uspešnost in pravilnost integracije. Kljub temu, da so konstrukti imeli loxP mesta, preko katerih bi s sistemom Cre-loxP lahko odstranili avksotrofne markerje, tega kasneje niso izvedli.

Vsi vneseni geni so bili pod kontrolo inducibilnega promotorja GAL1, ki s spreminjanjem razmerja med glukozo in galaktozo v gojišču omogoča regulacijo hitrosti izražanja in eksperimentalno določitev najboljšega razmerja.

5 Rezultati

Za pripravo kvasovke, ki je zmožna privzeti maksimalno količino soli, so ustvarili več mutant in jih testirali. Meritve so izvajali v mediju YPD z galaktozo in 0,6 M NaCl (približno toliko kot morska voda), rezultate pa podali kot odstotni delež, ki ga je predstavljala znotrajcelična koncentracija natrija glede na celotno koncentracijo natrija v raztopini pri enakem številu celic.

Vse razen ene mutante so se odrezale bolje kot kvasovka divjega tipa, najbolj učinkovita pa je bila mutanta VAULTer I, ki je akumulirala 39 % celotne koncentracije natrija v raztopini, medtem ko je bil delež pri kvasovki divjega tipa le 8 %. Kombinacija genskih modifikacij, ki jih ima VAULTer I so izbit gen za transporter ENA1 in vstavljena in prekomerno izražena gena transporterja AtNHXS1 in AVP1. Mutante z več genskimi modifikacijami so izkazovale manjšo rast, kot tiste z manj, kar je bilo verjetno posledica dveh dejavnikov. Po eni strani mutante s prekomerno izraženimi geni potrebujejo več energije za sintezo vseh proteinov in zato počasneje rastejo, po drugi strani pa akumulacija natrija zaradi njegovega toksičnega učinka na celico tudi upočasni rast.

Dobro se je odrezala tudi mutanta NAKT, ki akumulira kalij – v mediju YPD z galaktozo in 0,6 M KCl je bila učinkovitost privzema kalija približno 20 %.

Ker je natrij v celici toksičen, so morali njegov privzem zviševati postopoma, kar je omogočal inducibilen promotor GAL1, stremeli pa so seveda k čim večji znotrajcelični koncentraciji soli, pri kateri celice še preživijo. Da bi dokazali možnost regulacije hitrosti izražanja s promotorjem GAL1 so s kvantitativnim PCR v realnem času primerjali transkripcijo protonske črpalke AVP1 pri dveh različnih pogojih. V ta namen so izolirali mRNA iz divjega tipa, mutante AVP1, ki je rastla na mediju YPD s 100 % glukozo in mutante AVP1, ki je rastla na mediju YPD s 100 % galaktozo. Koncentracija AVP1-mRNA v mutanti AVP1, ki je rastla pri 100 % galaktozi je bila okoli 20-40-krat višja kot pri mutanti AVP1, ki je rastla pri 100 % glukozi. Rezultati prikazujejo možnost regulacije izražanja genov, ki so pod kontrolo promotorja GAL1, s spreminjanjem razmerja med glukozo in galaktozo v gojišču.

6 Praktična uporaba Solnega trezorja

Usoda okoljskega projekta kot je Solni trezor je odvisna od možnosti uporabe – v tem primeru je to razsoljevanje vode. Trenutno je za ta namen najbolj razširjena metoda reverzna osmoza. To je proces, pri katerem se z visokim tlakom vodo filtrira skozi membrano z majhnimi porami, ki so prepustne le za vodo, pri tem pa se voda popolnoma očisti vseh topljencev.

Za razsoljevanje odpadnih voda pred izpustom v reke bi bila uporaba reverzne osmoze zelo draga, z uporabo Solnega trezorja pa bi po drugi strani lahko sol odstranili na cenejši način. Razlika v ceni med reverzno osmozo in Solnim trezorjem tiči v velikosti por filtracijskih membran. Medtem ko imajo membrane za reverzno osmozo povprečno velikost por 0,4 nm, so membrane za odstranjevanje kvasovk mikrofiltracijske s povprečno velikostjo por 0,4 µm ali ultrafiltracijske s povprečno velikostjo por 0,04 µm. Kvasovke imajo premer 2-10 µm, zato bi zadostovala že mikrofiltracija. Razlika v velikosti por se odraža v različnih tlakih, ki so potrebni za potiskanje vode skozi membrano. Reverzna osmoza je zelo energijsko potratna prav zaradi velike tlačne razlike preko membrane, saj lahko ta doseže tudi 120 barov. Mikro- in ultrafiltracija sta s tega vidika znatno varčnejši, saj je potrebna tlačna razlika za mikrofiltracijo le 0,1-3 bare, za ultrafiltracijo pa 0,5 – 10 barov. Uporaba mikro- oz. ultrafiltracije se zaradi nižjih tlakov in posledično večje obstojnosti strojnih delov odraža v nižjem strošku.

Za prikaz delovanja Solnega trezorja v kombinaciji z ultrafiltracijo so uporabili peristaltično črpalko, ki ustvarja tlak okoli 0,5 bar, s katero so skozi ultrafiltracijsko membrano velikosti 2,5 dm2 uspeli prefiltrirati 0,625 l suspenzije kvasovk na uro. Ta pretok ustreza pretoku 7500 l/h preko membrane s površino 300 m2, kar je primerljivo z majhnimi čistilnimi napravami, ki uporabljajo membransko tehnologijo.

Za praktično uporabo Solnega trezorja pa se je potrebno posvetiti še dvema pomembnima vidikoma, to sta hranjenje kvasovk in uporaba odpadne biomase. Avtorji projekta predlagajo, da bi kvasovke hranili s kupljenim sladkorjem, saj so ocenili, da to ne bi predstavljalo prevelikega stroška. Odpadne kvasovke pa bi lahko uporabili kot dodatek bakterijski brozgi pri proizvodnji metana (in kasneje elektrike), saj se je izkazalo, da to znatno poveča njegovo proizvodnjo, sol pa naj na celoten proces ne bi imela negativnega vpliva.