Stabilizacija RNA pri hipertermofilnih arhejah

Uvod

V splošnem so hipertermofilni mikroorganizmi tisti, ki rastejo pri optimalni temperaturi višji od 80 °C. Večino hipertermofilov uvrščamo v domeno arhej in bakterij, nekaj tudi med evkarionte. Temperaturne spremembe spodbujajo evolucijo genoma, kar omogoča preživetje organizmov pri povišani temperaturi. Hipertermofilne arheje rodu Pyrodictium se nahajajo na dnu veje arhej v filogenetskem drevesu. Iz tega lahko sklepamo, da se je domena arhej razvila pri visokih temperaturah. Domnevajo, da je ta umestitev hipertermofilnih arhej posledica njihovega prilagajanja na nižje temperature, zato so razvile stresne proteine. Ker pa vemo, da hipertermofilne arheje obstajajo in se množijo v hidrotermalnih vrelcih pri 120 °C, morajo obstajati mehanizmi, ki ščitijo njihovo RNA. Analize so pokazale veliko količino različnih RNA molekul, predvsem nekodirajoče RNA, ki regulira gensko ekspresijo in sodeluje pri modifikacijah ribonukleinskih kislin. Visoke temperature razvijajo RNA in jo hidrolizirajo, kar ireverzibilno poškoduje njeno strukturo in vpliva na njeno funkcijo. Molekula RNA je bolj naklonjena hidrolizi kot DNA, ker lahko 2'-OH skupina riboze interagira s fosfatno skupino ogrodja, kar povzroči cepitev fosfodiestrske vezi.

Struktura RNA

Ena od najbolj očitnih značilnosti nekodirajoče RNA hipertermofilnih organizmov je veliko število dupleksnih zaporedij, ki se pojavljajo v zankah RNA. Dupleksna zaporedja so komplementarni deli verig RNA, ki so med sabo povezani preko vodikovih vezi. Tako nastane dvoverižna struktura, ki je stabilizirana z interakcijami med baznimi pari komplementarnih nukleotidov. Stabilne RNA so v hipertermofilih pred denaturacijo zaščitene z visokim deležem GC baznih parov in z modifikacijami nukleotidov, ki stabilizirajo njihovo sekundarno in terciarno strukturo. Do delne stabilizacije zank RNA lahko pride, zaradi povečanja deleža GC baznih parov, ki tvorijo tri vodikove vezi in so bolj stabilni kot AU pari. Drug način stabilizacije dupleksnih zaporedij komplementarnih verig RNA je zvišanje koncentracije soli v celici. Tm RNA se poviša pri višji ionski moči, zaradi negativnega naboja na fosfatno-sladkornem ogrodju. Nekateri hipertermofili imajo res višjo koncentracijo K+ ionov, vendar temu ni vedno tako. Večji vpliv ima višji delež prostih dušikovih skupin aminokislinskih ostankov, saj njihov pozitiven naboj ravno tako poviša Tm molekul RNA in vitro.

Stabilizacija SRP RNA s cirkularizacijo

Delci, ki prepoznajo signal (SRP-ji) so ribonukleoproteinski kompleksi, ki usmerjajo promet v celici. Tvorijo jih SRP proteini in SRP RNA. Arhejske SRP RNA imajo na 5' in 3' koncu dodana zaporedja, ki lahko tvorijo vijačnico H1. Njena vloga je preprečevanje razvijanja SRP RNA pri ekstremnih pogojih, kot je visoka temperatura. V parazitskem evkariontu Trichomonas tenax so raziskali kakšen vpliv ima permutacija gena, ki nosi zapis za SRP RNA. Ugotovili so, da sta nastala dva nova konca, ki lahko tvorita krožno SRP RNA molekulo, ta pa ima termostabilizacijski učinek. Krožna SRP RNA se lahko veže na SRP proteina SRP19 in SRP54. Del zaporedja, ki se je iz linearne oblike pretvori v krožno, obdela tRNA endonukleaza. Ta je običajno odgovorna za nastanek zrele tRNA tako, da tvori ustrezne 5' in 3' konce za aminoacetilacijo. V raziskavi so tako odkrili 'moonlighting' aktivnost tRNA endonukleaze (fenomen, ko ima en protein, za katerega so mislili, da ima le eno vlogo v celici, več različnih funkcij, ki niso povezane s prvotno). Posledica te aktivnosti omogoča nastanek stabilne in funkcionalne krožne molekule RNA.

Modifikacije RNA

Stabilne molekule RNA so pogosto podvržene post-transkripcijskim spremembam. Pri hipertermofilnih arhejah so s pomočjo masne spektrometrije identificirali veliko število modifikacij nukleozidov pri tRNA. Te modifikacije vplivajo na terciarno strukturo, interakcije kodon-antikodon in samo stabilnost. Najbolj razširjena modifikacija, ki jo najdemo v strukturah RNA je metilacija 2'OH skupine riboznega dela nukleozida oziroma 2'-O-metilacija, katera nudi zaščito pred razpadom fosfodiestrske vezi. Pri bakterijah so te spremembe razmeroma redke in jih uvedejo posebne metiltransferaze, ki so specifične za mesto ali regijo. Evkarionti in arheje pa imajo ribonukleoproteinske (RNP) komplekse, ki vsebujejo majhne RNA (sRNA), ki identificirajo tarče za 2'-O-metilacijo. Te molekule imenujemo C/D škatla (C/D box). Zanje so značilni štirje ohranjeni elementi zaporedja, okvir C in C' (5'-RUGAUGA-3') ter okvir D in D' (5'-CUGA-3'). Ti elementi se zvijejo v znan RNA strukturni motiv, kink-obrat oz. k-obrat. Nanj se vežeta dva proteina L7Ae, ki sta del RNP kompleksa. Tega sestavljata tudi proteina Nop5 (oziroma Nop56/58) in metiltransferaze fibrilarina. sRNA vodijo kompleks do tarčnih RNA in uvedejo 2'-O-metilacijo 5 nukleotidov pred prvo komplementarno bazo D ali D' zaporedja. Sama mesta modifikacij so bila identificirana v osrednjih regijah ribosoma, med veliko in malo podenoto, ter na mestih RNA-RNA interakcije. Te rRNA regije nimajo proteinske zaščite, zato zaščito nudijo modifikacije. Vsaka C/D škatla ima dve voditeljski zaporedji (ena pred D, druga pa pred D'), kar opozarja na koordinirano vodenje do tarč. Predlagana je dodatna funkcija C/D škatle, in sicer šaperonska, saj je med tarčnimi rRNA manj kot 100 nt. Tvorile naj bi se dvojne interakcije, ene za pomoč pri zvijanju in stabilizaciji rRNA in kasnejša 2'-O-metilacija, ki termostabilizira.

RNA vezavni proteini

Povečano število GC parov je osnovni mehanizem stabilizacije RNA pri ekstremnih pogojih, vendar ni opažen pri mnogih nekodirajočih RNA, vključno s C/D škatlo sRNA. Mehanizem, ki ga posvojijo je vezava proteinov na funkcionalno pomembne RNA komponente RNP kompleksov. Tak proces se na primer pojavi pri stabilizaciji CRISPR RNA, kateri tvorijo interakcije s Cas proteini za nastanek funkcionalnega efektorja. Pomembni proteini vključeni v stabilizacijo so člani proteinske družine L7Ae/L30e, ki vključuje arhejske L7Ae proteine in evkariontske homologe L30e. Njihova naloga je prepoznati motiv k-obrata in so direktno vključeni v stabilizacijo RNA. K-obrat ima tako vlogo vezavnega mesta za raznolike RNA vezavne proteine (RBP). Z imunoprecipitacijo je bil opažen mehanizem avtoregulacije proteina L7Ae, saj so identificiral več mRNA, ki kodirajo protein. Sama translacija L7Ae je regulirana z negativno povratno zanko. Predstavljena na primeru Archeoglobus fulgidus, se struktura kink-obrat nahaja na 5' neprevedeni regiji (UTR) mRNA. Ob odsotnosti vezavnega proteina je struktura motiva nestabilna oziroma razgrajena. To omogoča vezavo ribosoma in začetek translacije L7Ae. Ko pa je protein ponovno prisoten, se ta veže na 5'UTR regijo in stabilizira strukturo k-obrata. S tem blokira vezavno mesto za ribosom, translacije več ne poteče. L7Ae vpliva tudi na izražanje proteinov Nop5 in fibrilarina, s katerima se povezuje v RNP kompleks. Na stabilnost hipertermofilnih arhej tako ne vpliva le vezava L7Ae proteina, temveč tudi njegova regulacija.

Arhejski Lsm proteini

Pomembna družina RNA vezavnih proteinov so tudi arhejski Lsm (Sm-like) proteini. So podvrsta Sm proteinov, ki jih sicer najdemo pri bakterijah (Hfq) in evkariontih, kjer med drugim sodelujejo pri nastanku spliceosoma in izrezovanju intronov. Zaradi odsotnosti intronov v protein kodirajočih genih in drugačnega mehanizma procesiranja RNA pri arhejah, tu ni bilo pričakovati njihovega nahajanja. Le ti so bili odkriti z iskanjem zaporedja v podatkovni zbirki, obstoj pa je bil potrjen z določitvijo njihove strukture. Zaenkrat sta opisana dva taka proteina, Lsm1 in Lsm2, ki tvorita heptamerne ali heksamerne komplekse. Vežeta se predvsem na RNA bogato z uracilom. Delujeta lahko na podoben način kot evkariontski ali kot bakterijski Sm proteini. Slednji se obnašajo kot RNA šaperoni, ki omogočajo parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizacijo molekule sRNA . Medtem ko nekateri arhejski Lsm proteini, najdeni v drugih vrstah arhej, delujejo na bolj specifični in funkcionalni ravni procesiranja RNA, podobno kot evkariontski proteini, vendar natančen mehanizem delovanja še ni znan.

Poliadenilacija in eksonukleazna aktivnost

Na razgradnjo RNA molekul pri hipertermofilnih arhejah vpliva poliadenilacija. Hipertermofil Sulfolobus solfataricus vsebuje proteinski kompleks podoben eksosomu, ki izkazuje fosforolitično aktivnost odvisno od kovinskih ionov in poleg svoje eksoribonukleolitične aktivnosti katalizira tudi adicijo poliA repkov na 3'-konec RNA. Eksonukleazno aktivnost arhealnega eksosoma so potrdili s proučevanjem podobnosti s PNPazo v bakterijah. Ugotovljeno je bilo, da katalizira nastanek heteropolimernih repkov. Za razgradnjo RNA od 5'-konca proti 3'-koncu je odgovoren protein Sso-aCPSF2. Njegova tripartitna struktura omogoča eksoribonukleolitično aktivnost s substrati RNA. Deluje torej kot eksonukleaza in sicer z večjo afiniteto do RNA molekul z le enim fosfatom na 5'-koncu. Translacijski iniciacijski faktor a/eIF2 lahko veže mRNA s trifosfatom na 5'-koncu in jo tako zaščiti pred delovanjem eksonukleaz – npr. Sso-aCPSF proteina. Eksperimentalno je dokazano, da večja produkcija a/eIF2 poveča stabilnost mRNA molekul. Dodatno zaščito pred eksonukleazno aktivnostjo lahko zagotovimo z ligacijo prostih 5' in 3'-koncev, kar se odraža v nastanku krožne RNA. To ponazarja primer krožne T. tenax SRP RNA. V tej molekuli je vijačnica 1 nadomeščena z neprekinjenim zaporedjem, novi konci pa so prepoznani s pomočjo mehanizma za spajanje arhealne tRNA. Zrele krožne molekule RNA obstajajo brez prostih koncev in niso izpostavljene kot tarče za arhealne eksonukleaze, kar posledično poveča njihovo stabilnost.

Zaključek

Procesiranje obeh koncev RNA in status fosforilacije na 5'-koncu RNA predstavljajo pomembne determinante za stabilnost te molekule. Veliko ostalih mehanizmov prilagoditve RNA, da je le ta v okolju z višjimi temperaturami stabilna, je še neznanih in predstavlja možnost za nadaljnje raziskovanje na tem področju. Osredotočiti se je vredno predvsem na vlogo in mehanizem RNA-vezavnih proteinov, morebitno identifikacijo 5' NAD kap ter mehanizem metilacije mRNA molekule. Za nadaljnje eksperimentalno raziskovanje bo ključna kombinacija visoko zmogljivih tehnik sekvenciranja in klasičnih biokemijskih karakterizacij izolirane RNA iz hipertermofilnih arhej.

Viri

[1] Gomes-Filho JV, Randau L. RNA stabilization in hyperthermophilic archaea. Ann N Y Acad Sci. 2019 Jul;1447(1):88-96. doi: 10.1111/nyas.14060. Epub 2019 Apr 17. PMID: 30994930. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30994930/

[2] Becskei A, Rahaman S. The life and death of RNA across temperatures. Comput Struct Biotechnol J. 2022 Aug 8;20:4325-4336. doi: 10.1016/j.csbj.2022.08.008. PMID: 36051884; PMCID: PMC9411577. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36051884/

[3] Plagens A, Daume M, Wiegel J, Randau L. Circularization restores signal recognition particle RNA functionality in Thermoproteus. Elife. 2015 Oct 24;4:e11623. doi: 10.7554/eLife.11623. PMID: 26499493; PMCID: PMC4731332. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4731332/

[4] Fischer S, Benz J, Späth B, Maier LK, Straub J, Granzow M, Raabe M, Urlaub H, Hoffmann J, Brutschy B, Allers T, Soppa J, Marchfelder A. The archaeal Lsm protein binds to small RNAs. J Biol Chem. 2010 Nov 5;285(45):34429-38. doi: 10.1074/jbc.M110.118950. Epub 2010 Sep 7. PMID: 20826804; PMCID: PMC2966057. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2966057/

[5] Dennis PP, Tripp V, Lui L, Lowe T, Randau L. C/D box sRNA-guided 2'-O-methylation patterns of archaeal rRNA molecules. BMC Genomics. 2015 Aug 22;16:632. doi: 10.1186/s12864-015-1839-z. PMID: 26296872; PMCID: PMC4644070. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26296872/