Stroškovno učinkovita proizvodnja rekombinantnih peptidov v Escherichia coli

Protimikrobni peptidi

Protimikrobni peptidi -AMPs (ali »Host defence peptides-HDPs«) so majhni kationski bioaktivni peptidi, ki so del prirojenega imunskega sistema veliko organizmov. Zaradi širokega spektra bioloških aktivnosti, dokazano uničujejo tako gram pozitivne kot tudi gram negativne bakterije, viruse, glive kot tudi rakave celice, imajo AMP-ji širok uporabnost, tako terapevtsko, kot tudi industrijsko. Do danes je bilo odkritih več kot 2 500 različnih protimikrobnih peptidov. V glavnem je njihova izolacija in pridobivanje zamudno in zelo oteženo pri večjih količinah peptidov. Njihova kemijska sinteza je sicer učinkovita, vendar na majhne količine omejena s samo dolžino peptida (nekje do 30 aminokislin).

Zaradi neučinkovitosti takih sintez je rekombinanta DNA tehnologija način profitabilne in učinkovite proizvodnje takih peptidov. Kljub uspešnemu pridobivanju določenih AMP-jev z rekombinantnimi tehnikami v Escherichia coli, naletimo tudi pri tem na določene težave. Protimikrobne lastnosti peptidov jih naredijo potencialno nevarne za baterije proizvajalke. Zaradi majhne velikosti in kationske narave so toliko bolj dovzetni za proteolitično razgradnjo.

Primerna tehnika, ki zaobide slednje težave, je priprava fuzijskih proteinov. Peptidi so s fuzijo pripreti tako na nosilni protein, iz katerega se cepijo s kemijsko cepitvijo na točno določenem mestu na med nosilni proteinom in petidom. Taka oblika spominja na prekurzorsko obliko petidov, kjer nosilni protein prevzame vlogo pro-segmenta naravnega peptida. Tako se izognemo tokisičnosti do bakterij v kateri proizvajamo peptid in proteolitični degradacijami s proteazami. Tak nov nosilni protein predstavlja denaturirana onkonaza (ONC), ribonukleaza. Je majhen protein ki je lahko izražena v velikih količinah v inkluzijskih telescih. Njena topnost pa je močno odvisna od pH (denaturirana oblika topna samo pri pH = 4), kar omogoča čiščenje AMP-jev topnih pri pH 7. Takim himernim konstruktom so dodali His tag zaporedje za lažje čiščenje in pa kratek »linker« ter Asp-Pro dipeptidom ki se cepi v kislih pogojih, kar sprosti peptid iz nosilca.

Novo gojišče in avto-indukcija

NAB

V članku so razvili novo tekoče gojišče in vzpostavili avto-inducirano izražanja v namen razširitve proizvodnje peptidov na velik in učinkovit obseg. Postopek so uspešno uvedli za peptid GKY20 – kratek kationski AMP iz C-končne regije človeškega trombina ter za dva HDP-ja, ki sta izoforma humanega Apolipopreteina B (ApoB). V eksperimentih so uporabili seve E.coli BL21(DE3) in BL21(DE3)pLysS. Za pripravo fuzijskih proteinov so vzeli cDNA zapisujoče za protimikrobne peptide in jih klonirali v vektorju pET-22b(+). Na novo so razvili gojišče delno definirano srednje bogato gojišče poimenovano tekoče gojišče Notomista-Arciello (NAB), v želji da bi dobili veliko celično gosto in višje izražanje rekombinantnih peptidov. V gojišču NAB so izvlečke kvasovk zamenjali s triptonom. Ker tripton lahko vsebuj laktozo, so dodali gojišču tudi glukozo v izogib bazalni indukciji izražanja rekombinantih konstruktov. V NAB so dodali tudi mešanico soli za zagotavljanje optimalne količine kofaktorskih kovinskih ionov. Poleg tega so dodali še amonijev citrat, ki je služil koz pufer in kot kelator, ter osmolit betain. NAB gojišče so primerjali s konvencionalnim tekočim gojiščem TB, tako da so transformirane bakterijske celice gojili v obeh ob prisotnosti ampicilina. Izražanje peptidov v NAB gojišču je bili 1.5-1.6 krat večje kot v TB gojišču. NAB gojišče v primerjavi tako omogoča večjo biomaso in večjo proizvodnjo fuzijskega proteina.

Avto-indukcija izražanja peptidov

V želji, da bi dodatno optimizirali in vidno zmanjšali stroške proizvodnje, so vpeljali avto-indukcijski protokol. Gojišče NAB se je izkazalo primerno za ta protokol, zaradi primerne vsebine anorganskih soli. Gojišču so dodali 0,4% glicerola, 1,92 g/L laktoze in 0,5 g/L glukoze (za hitro rast celic in zaustavljanje razgradnje laktoze) – iNAB gojišče. Na ta način se je razgradnja laktoze šele začela po porabljeni glukozi in s tem avtomatsko inducirala izražanje rekombinantnega proteina pod promotorjem T7. temu tako je zaradi diauksičnega premika. Za razliko pri postopkih z IPTG indukcijo, je indukcija tukaj avtomatska in ni potrebnega nadzora.

Povečanje na industrijsko raven

Sledilo je povečanje produkcijskega postopka na 5 litrske fermentorje (biorekatorje). Kot poprej so tudi tukaj optimizirali postopek naprej z NAB in IPTG indukcijo in ga primerjali z postopkom v iNAB gojišču. V primerjavi z navadnim postopkom, je v pri avto-induciranem postopku nivo izražanja himernega proteina bil višji.

Čiščenje peptida so izvedli tako, da so fuzijski protein izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo. Peptid so nato na to odcepili s onkonaze s kislinsko hidrolizo, ki so jo oborili pri ph 7 peptid so izolirali s centrifugiranjem in liofilizacijo. Po zgoraj opisanih postopkih so pridobili 99% čisti peptid s koncentracijo 40-50 mg/L. Z gelsko filtracijo so dokončno očistili peptid in dobili 20-25 mg čistega peptida na liter bakterijske kulture.

V izračunih stroškov so ugotovil, da so stroški na majhni 5 L skali nekje 250 €/mg in so večinoma definirani preko stroška delavcev, same investicije in vzdrževanja opreme. Če pa proizvodnjo povečamo na 200, 500 ali 1000 mg na šaržo, se temu primerno stroški znižajo na 136, 65, 42 €/mg. Sorazmerno padejo tudi stroški delavcev temu primerno, saj za povečan obseg ni potrebno večjega nadzora. V primerjavi s kemično sintezo in pa v primerjavi s sintezami drugih podobnih peptidov je ta opisana proizvodnja boljša oziroma vsaj kompetentna alternativam.

Viri in Literatura

[1] C. H. Henry and L. Xiaoming, “Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements,” pp. 383–399, 2012.
[2] B. G. Fox and P. G. Blommel, “Autoinduction of Protein Expression,” pp. 1–18, 2009.
[3] A. R. Gaglione, K. Pane, E. D. Olmo, V. Cafaro, E. Pizzo, G. Olivieri, and A. Arciello, “SC,” N. Biotechnol., 2019.