Telomeraze

Uvod

Telomeri, specifična ponavljajoča se zaporedja nukleotidov na koncu kromosomov, v celici in v procesu celičnega cikla opravljajo mnogo pomembnih bioloških funkcij. Kromosome varujejo pred rekombinacijo, mnogo prispevajo tudi k njihovi organizaciji in regulaciji genov, ohranjanje njihove dolžine pa je bistveno za genomsko stabilnost. Vendar pa sama replikacija kromosomov za celico predstavlja težavo. Običajna DNA polimeraza namreč ni zmožna v celoti podvojiti 3' konca zastajajoče verige DNA, zaradi česar se telomeri ob vsaki delitvi skrajšajo za 50-200 baznih parov, telesne celice pa so tako podvržene le omejenemu številu celičnih ciklov. Narava je skozi evolucijo sicer razvila mnoge rešitve, ki so povezane s problemom podvojevanja koncev kromosomov. Pri veliki večini vseh evkariontskih organizmov to funkcijo opravljajo telomeraze – encimi, ki v celoti zagotovijo popolno replikacijo koncev kromosomov.

Človeške telomeraze: struktura in funkcija

Telomeraze so ribonukleinski encimski kompleksi, ki katalizirajo ustrezno sintezo ujemajoče verige na telomernih koncih kromosomov. Večina človeških somatskih tkiv telomerazne aktivnosti ne izvršuje, po drugi strani pa je ta precej izrazita ob prisotnosti tumorjev. Telomeraze so v zgodnjih fazah embriogeneze sicer prisotne v večini celic, tudi somatskih, njihovo nadaljnje zavrtje pa sovpada z diferenciacijo tkiv. Po rojstvu se telomeraze tako nahajajo le v kličnih in matičnih celicah, medtem ko jih v somatskih celicah večinoma ni. Izjeme so le specifične proliferirajoče epitelijske celice različnih tkiv in pa nekatere celice imunskega sistema (limfociti).

Telomeraze so sestavljene iz dveh ključnih komponent. Ena od teh je funkcionalna RNA molekula (hTR), ki služi kot matrica pri podvajanju telomerne DNA, druga komponenta pa je katalitični protein s funkcijo reverzne transkriptaze (hTERT). hTR je vedno prisotna v vseh tkivih oziroma celicah, v nasprotju s tem pa je izražanje gena hTERT natančno uravnano in povezano le s pojavom telomerazne aktivnosti.

Izgradnja aktivnega telomeraznega kompleksa sicer zahteva mnogo vmesnih stopenj. Sam proces vključuje mnogo raznih komponent in dodatnih proteinov, ki oblikujejo aktiven holoencim v obliki dimera. Glavni podenoti telomeraze sta med seboj povezani s proteinom TEP 1, pomembno funkcijo pri zgradbi človeških telomeraz pa opravljata tudi proteina Hsp90 in p23 - molekulska šaperona, vezana na podenoto hTERT, ki pomagata pri sestavljanju podenot.

Telomerazna RNA (hTR)

Pri ljudeh se hTR sintetizira z delovanjem RNA polimeraze II. Zrelo obliko hTR gradi 451 nukleotidov, njeno aktivno mesto pa je funkcijsko razdeljeno na dva dela. Zaporedje, ki se nahaja na 3' koncu hTR, prepoznava komplementarna telomerna zaporedja, z njimi tvori bazne pare in tako omogoči prileganje celotnega telomeraznega kompleksa. Zaporedje, ki je bližje 5' koncu, pa predstavlja matrico katalitični podenoti pri sintezi komplementarnega zaporedja telomerov.

Celotna sekundarna zgradba hTR vključuje štiri glavne strukturne elemente oziroma t.i. domene: CR2/CR3, CR4/CR5, škatlo H/ACA oziroma CR6/CR8 in CR7. Številni in vitro poskusi pa so dokazali, da za uspešno delovanje telomeraze vsi ti elementi niso tudi nujno potrebni.

Katalitična podenota (hTERT)

hTERT je katalitična podenota telomeraznega kompleksa s funkcijo reverzne transkripcije, ki je glede na funkcijo in strukturne lastnosti precej primerljiva z retrovirusnimi reverznimi trankriptazami. Gre za protein s približno 1100 aminokislinami, ki vsebuje več ključnih domen. Na N-terminalnem koncu se nahaja TEN domena, ki veže telomerno DNA, sledi ji upogljiva in fleksibilna povezovalna regija, ki pa se nato nadaljuje v TRBD domeno, kamor je vezana telomerazna RNA. Nadaljevanje proteina gradi ključna regija - RT domena s funkcijo reverzne transkriptaze, na koncu pa se nahaja CTE domena.

Telomeraze kvasovk

Telomerazni kompleks oziroma domnevne komponente telomeraze so identificirali pri S. cerevisiae, S. pombe, K. lactis, C. albicans. Gre za stabilne komplekse ribonukleoproteinov (RNP) v velikosti 1000 – 1500 kDa. Vsak encim ima TERT podenoto in matrico, ki vsebuje RNA.

Telomeraza kvasovk je encim, sestavljen iz 1157 nukleotidov RNA (TCL1) in drugih proteinskih podenot: Est2p – katalitična podenota s funkcijo reverzne transkriptaze (TERT), Est1p in Est3p – proteina, ki sodelujeta pri regulaciji dolžine telomer ter pomožnih proteinov Ku, in sedmih proteinov Sm, ki so vključeni v zorenje ribonukleoproteinov.

Razpoznavni znak funkcionalne RNA molekule kvasovk – TER (TLC1) je njihova velikost oziroma dolžina. Medtem ko je RNA migetalkarjev dolga okrog 200 nukleotidov (nt), RNA vretenčarjev pa okrog 400-500 nt, je RNA kvasovk daljša ali enaka 1000 nt. Pri funkcionalni analizi TER so večino mutacij ugotovili v regiji matrice, te mutacije pa največkrat povzročajo spremembe v zaporedju telomerov. Spremembe v zaporedju pogosto motijo nukleoproteinsko sestavo telomere, kar vodi do raznolikosti v dolžini ter strukturni deregulaciji in do okvar v stabilnosti in funkciji kromosoma.

Telomeraza kvasovk lahko doda okoli 15 nt na začetni primer, sintezo pa zaustavi oziroma zaključi preko regije matrice, kar se razlikuje od telomeraze sesalcev pri katerih se sinteza zaključi oziroma zaustavi na 5’ koncu matrice. Sinteza se lahko konča kljub temu, da je produkt še vedno vezan na encim. Za telomerazo kvasovk velja, da je omejena na en sam krog razširitve. Kot druge telomeraze, tudi telomeraza kvasovk katalizira cepitev nukleotidov.

Katalitična podenota (Est2p)

Protein TERT je pri kvasovki S. cerevisiae velik 134 kDa. Ima štiri strukturne in funkcionalne domene: N-konec, TRBD domena, RT domena (funkcija reverzne transkriptaze) in C-konec. Regije TERT so pomembne za aktivnost in vezavo na RNA telomerazo. N – konci so pri kvasovkah bistveno krajši kot pri človeški telomerazi ter vsebujejo šest regij.

Proteini (Est1p, Est3p, Cdc13p, Sm)

S telomerazo povezani proteini niso bistveni za katalitično aktivnost in vitro, vendar pa nekateri uravnavajo aktivnost telomeraze in vivo. Est1p, Est3p in Cdc13p z direktnimi in indirektnimi povezavami s telomerazno RNA in Est2p komponentami uravnavajo dostop telomeraze na telomere.

Est1p je prva klonirana podenota telomeraze kvasovk S. Cerevisiae. Bistvenega pomena je za vzdrževanje telomer. Est3p je relativno majhen protein. Natančna funkcija Est3p proteina ni znana, ni pa vključen v premestitev telomeraze na konce telomer.

Sm proteini: domnevno vezavno mesto Sm proteinov je na 3’ koncu TLC1 RNA. Smd1p je potreben za akumulacijo TLC1 RNA. Smd1p in Smd3p (ter verjetno tudi drugi Sm proteini) so povezani s telomeraznim kompleksom in potrebni za akumulacijo telomeraze RNA.

Telomeraze pri rakavih in normalnih celicah

Stopnja telomerazne aktivnosti je odvisna od vrste in starosti celic. Z diferenciacijo tkiv se njena aktivnost zmanjšuje in na koncu embriogeneze so telomeraze zavrte, proliferacija je prekinjena. Imamo pa tudi izjeme. Pri nekaterih celicah ostane telomeraza namreč tudi po diferenciaciji še vedno aktivna.

Rak in telomeraze

Nekatere celice lahko postanejo nesmrtne in sicer tako, da pride do reaktivacije telomeraze. Pri tem pride do izgube specifičnih represivnih genov, ki zavirajo izražanje telomeraze. Pri kancerogenezi (malignih tumorjih) aktivna telomeraza omogoči stabilizacijo koncev kromosomov, genomsko stabilnost, neomejeno proliferacijo in razvoj celične nesmrtnosti.

Mortalitetni stadij 1 (M1) in mortalitetni stadij 2 (M2)

Vsaka celica ima dve nadzorni točki, ki preprečujeta neomejeno delitveno sposobnost normalnih celic. Ti dve točki sta M1 in M2. V stanju M1 (replikativno staranje) so celice vitalne, vendar se nič več ne delijo. Normalnim celicam se telomeri krajšajo in celični DNA popravljalni mehanizmi prepoznajo kratke telomere kot okvare v DNA in zato ustavijo celično delitev ter sprožijo celično staranje ali apoptozo. Da v M1 ustavimo celično delitev, potrebujemo normalno delovanje genov p53 in Rb (zavirata tumorje). V rakavih celicah so virusni onkoproteini (E6 in E7 humanega virusa papiloma 16, veliki T-antigen virusa SV40), ki vežejo p53 in pRb ter tako omogočijo nadaljevanje delitev celic. Te celice, ki zaobidejo M1 kontrolno točko, vstopijo v podaljšano življenjsko dobo, kjer se celice še nadalje delijo, telomeri pa se krajšajo. Ko ti postanejo kritično kratki in kromosomi izredno nestabilni, nastopi stanje krize-kontrolna točka M2. Večina celic tedaj umre. Vendar nekatere celice z reaktivacijo telomeraze preprečijo krajšanje telomer in zaobidejo tudi kontrolno točko M2. Takšne celice imajo neomejeno proliferacijsko sposobnost in postanejo nesmrtne.

TERT: funkcija in transport

TERT je katalitična podenota telomeraznega kompleksa. Izražanje hTERT je povezano s telomerazno aktivnostjo in nastankom ter razvojem raka. V normalnih celicah je ekspresija hTERT zavrta, med nastankom nesmrtnosti pa je ponovno aktivirana. Količina gena za hTERT je v tumorskih celicah pogosto povečana, kar prispeva k povečani aktivnosti telomeraze in nesmrtnosti celic.

TERT se v citoplazmi poveže z jedrnim faktorjem NFkBp65, ki ima pomembno vlogo pri jedrni translokaciji telomeraze in pri njeni regulacji. TNFα (tumor necrosis factor α) aktivira NFkBp65 in povzroči translokacijo kompleksa TERT- NFkBp65 iz citoplazme v jedro. V normalnih celicah se potem transport nadaljuje iz jedra v jedrce. Pri rakavih celicah pa je protein TERT razširjen predvsem v nukleoplazmi, kjer je prisotna večina substratov za sestavo telomeraznega kompleksa (TR, p23 in Hsp90). Jedrni protein hPinX1 se veže s TERT in inhibira encimsko aktivnost telomeraze. hPinX1 povzroči povečan transport TERT iz nukleoplazme v jedrce. Tu se nahajajo jedrni proteini nucleolini, ki tvorijo kompleks s telomerazo in povzročijo njen premik iz jedrca v nukleoplazmo.

Zdravljenje raka

Povečana stopnja aktivnosti telomeraze in količina mRNA za katalitično podenoto encima telomeraze sta ena izmed glavnih pokazateljev za razvoj raka. Razvoj zdravil za to bolezen je usmerjen predvsem na zaviralce telomerazne aktivnosti in na sestavine, ki bi delovale na telomere in posledično zavrle delovanje telomeraze.

Viri

• Cong, Y.-S., Wright, W. E., & Shay, J. W. (2002). Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR, 66(3), 407–25.
• Legassie, J. D., & Jarstfer, M. B. (2006). The unmasking of telomerase. Structure (London, England : 1993), 14(11), 1603–9.
• Sandin, S., & Rhodes, D. (2014). Telomerase structure. Current Opinion in Structural Biology, 25C, 104–110.
• Wojtyla, A., Gladych, M., & Rubis, B. (2011). Human telomerase activity regulation. Molecular Biology Reports, 38(5), 3339–49.
• Zappulla, D. C., & Cech, T. R. (2004). Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(27), 10024–9.