The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev

The real MVP<ref>iGEM 2019 team TU Darmstadt. The real MVP. 18.4.2020. [citirano 18.4.2020] https://2019.igem.org/Team:TU_Darmstadt</ref> je študentski projekt, s katerim je ekipa tehniške univerze v Darmstadtu nastopila na tekmovanju iGEM 2019. Cilj projekta je priprava ekspresijskega sistema, s katerim bi lahko pripravili modularne virusom podobne delce za enostavno pripravo dostavnih sistemov.

Virusom podobni delci

Virusom podobni delci (VLP) so nanodelci, ki nastanejo s spontano sestavo virusne kapside. Čeprav so podobni virusom, se od njih razlikujejo v tem, da ne vsebujejo DNA oziroma RNA. Kljub temu so zmožni vstopiti v tarčne celice. Interes za nove virusom podobne delce je spodbudil uspešen razvoj cepiva proti virusu hepatitisa B, k čemur so pripomogli 22 nm veliki prazni delci, sestavljeni iz proteinov virusnega plašča, ki so jih znanstveniki uspeli izolirati iz okuženih celic<ref>C. Ludwig, R. Wagner: Virus-like particles–universal molecular toolboxes. In "Current opinion in Biotechnology"; Elsevier Ltd. 2007, "18", 537–545.</ref>.

Projekt The real MVP

Študentje so želeli pripraviti ekspresijski sistem za pripravo virusom podobnih delcev, kjer bi plaščnim proteinom dodali C-končni prepoznavni motiv sortaze A, ta pa bi nato omogočala pripenjanje poljubnih, N-končno označenih proteinov. Delce so želeli pripraviti in vitro ter in vivo, jih očistiti in določiti njihove lastnosti.

Sortaze

Sortaze so encimi, ki spadajo v družino transpeptidaz in jih najpogosteje najdemo v gram-pozitivnih bakterijah. Njihova vloga je pripenjanje površinskih proteinov s pravim peptidnim C-končim prepoznavnim zaporedjem na celično steno bakterij. Glede na prepoznavni motiv jih delimo v tri skupine, sortaze A, B in C, ki jim je skupno zaporedje aminokislin TLXTC v aktivnem mestu ter nekaj posameznih pozitivno nabitih ostankov<ref>K. W. Clancy, J. A. Melvin, D. G. McCafferty: Sortase transpeptidases: Insights into mechanism, substrate specificity, and inhibition. In "Peptide Science"; Wiley Periodicals, Inc. 2010, "94", 385–396.</ref>.

Sortazi A5M in A7M

Študentje so uporabili sortaze razreda A iz bakterije Staphylococcus aureus, ki pripenjajo glikoproteine na površino celic. Encime sestavlja osem β-ploskev, ki tvorijo β-sodček. Aktivnost encimov tega razreda se poveča z vezavo kalcija na aminokislinske ostanke zanke, ki povezuje ploskvi β6 in β7. Reakcijo sproži kovalentna vezava C-končnega LPETGG motiva substrata v aktivno mesto encima. Cisteinski ostanek 184 napade peptidno vez med glicinom in treoninom zaporedja LPETGG, protoniran histidinski ostanek sortaze na mestu 120 omogoči protonacijo aminske skupine glicina ter s tem odcep te aminokisline od zaporedja. Nato drug glicin kot nukleofil lahko napade nastalo tioestrsko vez. Glede na to, da so v aktivnem mestu aminokisline protonirane, je reakcija močno odvisna od pH. Sortaze A so katalitično aktivne v območju pH od 3 do 11, optimalno pa delujejo pri pH 8.

V projektu je ekipa uporabila sortazo A5M, ki je izvedba sortaze A s petimi mutacijami (P94R, D160N, D165A, K190E in K196T), ki vplivajo na 140-kratno povišano katalitično aktivnost. Ker pri in vivo pogojih ravni kalcijevih ionov, od katerih je odvisna aktivnost sortaz A, močno variirajo, so preizkusili tudi sortazo A7M, ki ni odvisna od prisotnosti kalcijevih ionov.

Zapisa za sortazi A5M (BBa_K3187016) in A7M (BBa_K3187028) je ekipa z restrikcijskimi endonukleazami NdeI in SalI ter tehniko lepljenja po Gibsonu vstavila v vektor pET24(+). Vektor vsebuje gen za rezistenco na kanamicin ter inducibilen promotor T7. Pripravljene plazmide so izrazili v celicah BL21[DE3]. Encime so izolirali s homogenizacijo celic z EmulsiFlex in afinitetno kromatografijo z oznakami His-Tag in Strep-Tag II. Velikost encimov so določili na gelu NaDS-PAGE ter okarakterizirali lastnosti sortaz prek analize Försterjevega resonančnega prenosa energije (FRET). Aktivnost encimov so preverili s katalitično povezavo proteina TAMRA s C-končno oznako LPETG in sfGFP z N-končno oznako GGGG, pri čemer so zaznali prenos fluorescence z enega na drugi fluorofor, kar je potrdilo, da sta tako pripravljena encima aktivna.

Priprava virusom podobnih delcev

in vitro

Za sestavo virusom podobnih delcev so izbrali ponavljajoča se plaščni (CP) in ogrodni protein (SP), ki sestavljata kapsido bakteriofaga P22. Tako sestavljeni delec P22 VLP vsebuje 420 kopij CP, ki skupaj prispevajo maso 46,6 kDa in 100 do 300 kopij SP, ki k masi prispevajo skupno 18 kDa. Proteina tvorita prokapsido v obliki ikozaedra.

Zapis za plaščni protein z dodanim C-končnim zaporedjem LPETGG so z restrikcijo in ligacijo vstavili v plazmid pET24 (BBa_K3187000) ter z metodo lepljenja po Gibsonu v plazmid pACYCT2 vnesli zapisa za ogrodni protein in super-zvito obliko zelenega fluorescirajočega proteina (sfGFP) (BBa_K3187003). S tako pripravljenima plazmidoma so transformirali celice BL21[DE3]. Proteina so izrazili prek induktivnega promotorja T7 in ju očistili s hitro tekočinsko proteinsko kromatografijo z uporabo aminokislinske oznake Strep tag II ter velikost produktov določili z metodo prenosa Western.

Tako pripravljena fuzijski protein sfGFP-SP in CP so združili v molskem razmerju 1:2,8 ter VLP-je ločili z grandientnim centrifugiranjem skozi saharozo na ultracentrifugi. Usedle delce so zaznali preko fluorescence ter velikost 60 nm kapsid določili s presevnim elektronskim mikroskopom (TEM).

in vivo

Za sestavo VLP in vivo so bakterije seva BL21[DE3] kotransformirali s plazmidom pET24 z zapisom za CP-LPETG in plazmidom pACYCT2 z zapisom za sfGFP-SP. Sestavljene VLP so izolirali prek lize celic z uporabo ultrazvoka in centrifugiranjem. V nadaljevanju so VLP od ostalih komponent ločili z gradientnim ultracentrifugiranjem skozi saharozo. Za odstranitev endotoksinov so uporabili velikostno izključitveno kromatografijo ter velikost 60 nm VLP potrdili s TEM.

Določitev lastnosti pripravljenih VLP

Primerjava nivoja endotoksinov pri in vivo ter in vitro proizvodnji

Endotoksini so pirogeni, ki v in vivo lahko sprožijo številne biološke odzive, zaradi česar je potrebno, da se jih iz končnih produktov odstrani. Za določitev ravni endotoksinov v P22 VLP proizvedenih in vivo ter in vitro so uporabili LAL test. Izoliranim P22 VLP proizvedenim in vitro so določili nizko raven prisotnih endotoksinov, pri tistih proizvedenih in vivo pa je bila raven previsoka, kar bi v nadaljevanju zahtevalo izboljšavo izolacije.

Določanje velikosti kapsid

S slikanjem s presevnim elektronskim mikroskopom je ekipa študentov določila velikosti VLP 57 nm ± 3 nm. Za meritve velikosti večjega števila VLP so uporabili tehniko dinamičnega sipanja svetlobe, ki je kot rezultat podala hidrodinamski premer delcev 112,4 nm ± 42,31 nm, kar je večji radij, kot bi ga pričakovali na podlagi slik TEM, a je tehnika hkrati potrdila, da je sistem monodisperzen.

Kapside zgrajene le iz plaščnih proteinov

Ekipi je uspelo pripraviti tudi VLP sestavljene iz kapsid, ki so jih tvorili le plaščni proteini. Velikost le-teh so določili s presevnim elektronskim mikroskopom, pri čemer je ta znašala 53 nm ± 4,3 nm, kar kaže, da so tako nastali VLP nekoliko manjši.

Pripenjanje na plaščni protein bakteriofaga P22

S sortazo A7M je ekipa uspešno katalizirala reakcijo pripenjanja GGGG-mCherry na CP-LPETGG pri čemer so na gelu NaDS-PAGE zaznali lise pri dolžini predvideni za velikost produkta. Poleg tega je bilo prisotnih tudi več lis, ki jih niso pričakovali in so jih pripisali povezavam, tvorbo katerih bi lahko encim sortaza katalizirala med prostimi proteini CP-LPETGG ter GGGG-mCherry. S sortazo A5M je ekipa na sintetizirane VLP, kjer je bila CP dodana oznaka LPETGG, uspešno pripela GGGG-sfGFP. Tako pripravljene delce so ločili z gradientnim ultracentrifugiranjem ter fluorescirujoči sediment analizirali s TEM, v katerem so našli pričakovane VLP.

Priprava modularnega ekspresijskega sistema

Za razširitev uporabnosti sistema VLP je ekipa želela razviti ekspresijski mehanizem, ki bi omogočal pripravo delcev z različnim razmerjem med modificiranimi in nemodificiranimi plaščnimi proteini. Načrtali so ekspresijski vektor, kjer sta bila zapis za sfGFP pod kontrolo promotorja T7 in zapis za mCherry pod kontrolo promotorja tetA vnesena v plazmid pTeTW3con2 (BBa_K3187011). S spreminjanjem koncentracij induktorjev izopropil ß-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) in anhidrotetraciklina (AHT) so določevali nivo izražanja posameznih genov. Ugotovili so, da sta intenziteti fluorescence proteinov mCherry in sfGFP po prekonočnem izražanju v prisotnosti zgolj 0,2 µg/mL induktorja AHT enaki, pri čemer so nepričakovano izražanje gena za sfGFP pripisali spremembi sekundarne strukture plazmida v prisotnosti induktorja AHT. V nadaljevanju so okarakterizirali proces izražanja genov v prisotnosti zgolj enega induktorja. Izmerjene podatke razmerja fluorescence proteinov mCherry in sfGFP v odvisnosti od dodane koncentracije AHT so uporabili za prileganje modelne funkcije in pripravo nastavitev bioreaktorja.

Načrtali so tudi plazmid pTeTW3con2 v katerega bi vstavili zaporedje, kjer bi promotor T7 nadziral izražanje plaščnega in ogrodnega proteina bakteriofaga P22, tetA promotor pa bi nadziral izražanje plaščnega proteina s C-končno oznako LPETGG (BBa_K3187013). Na ta način bi z različnimi koncentracijami dodanih induktorjev IPTG in AHT lahko nadzirali, koliko CP z oznako LPETGG bi se vgradilo v VLP.

Zaključek

S projektom so študentje dokazali, da je z uporabo pristopov sintezne biologije možno pripraviti virusom podobne delce, na katere je mogoče s preprosto uporabo encima sortaze pripeti proteine z določenim N-končnim zaporedjem aminokislin. Projekt tako prispeva k razvoju standardiziranih postopkov priprave te vrste nanodelcev za aplikacije v bionanotehnologiji.

Viri

<references/>