Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala
Uvod
Sinetzna biologija se je izkazala kot primeren pristop za uporabo na prokariontskih celicah, medtem ko uporaba na evkariontskih organizmih peša. Do sedaj so identificirali le en tip RNA-stikala (tiamin pirofosfat), ki je primeren za evkariontske celice, medtem ko pri prokariontskih poznamo preko 40 različnih tipov takšnih stikal (Mccown idr. 2017). Na ravni evkariontske transkripcije poročajo predvsem o regulaciji preko modificiranih promotorjev, ki sodelujejo pri prepisu (Dalchau idr. 2018). Na postranskripcijski ravni pa se v študijah načeloma odločajo za regulacijo in kontrolo preko mikro-RNA. miRNA so endogene, enoverižne RNA, ki uravnavajo izražanje genov in so pomembne pri številnih fizioloških in patoloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, razvoj in apoptoza. Zaradi napisanega predstavljajo odlične kandidate za načrtovanje stikal; orodij sintezne biologije za gensko regulacijo in posledično aplikacijo pri višjih evkariontih (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).
V izbrani študiji so za aplikacijo detoksifikacijskih orodij sintezne biologije za terapevtske namene uporabili miRNA stikalo. To uravnava izražanje encima odstranjevalca oz. čistilca (angl. scavenger) v prisotnosti določene toksične male molekule. V opisani študiji je bil za prikaz koncepta encima odstranjevalca izbran citokrom P450 1A2 (kasneje imenovan CYP1A2). Znano je, da naddružina citokromov P450 igra pomembno vlogo pri zmanjševanju škodljivih vplivov različnih toksinov. Presnavljajo približno 60 % farmacevtskih spojin, citokrom P450 1A2 pa metabolizira razne farmacevtsko pomembne učinkovine, med drugim večino teofilina, ki se uporablja za zdravljenje vseh oblik astme, kroničnega obstruktivnega bronhitisa, pljučnega emfizema in pljučne hipertenzije (Gong, Du, in Du 2018). V študiji so za delovanje miRNA stikala uporabili visoko specifičen aptamer, ki se je z visoko afiniteto vezal na teofilin.
Rezultati
Kontrola znotrajcelične aktivacije encima odstranjevalca
V raziskavi so izkoristili že obstoječi celični interferenčni sistem in načrtovali miRNA stikalo, ki s svojim delovanjem prilagaja izražanje encima CYP1A2. Za izvedbo eksperimenta je bila uporabljena celična linija HEK-293. Utišanje gena CYP1A2 je povzročila miRNA, ki ima v svojo sekvenco vgrajen aptamer, ki se sicer veže na toksin (teofilin). Če je teofilin prisoten, se aptamer nanj veže, spremeni se sekundarna struktura miRNA, s čimer se primarno miRNA zamaskira, da ne pride do encimske predelave (ki jo sicer izvede proteinski kompleks Drosha) do prekurzorske miRNA. Rezultat tega je povečano izražanje encima CYP1A2. Encimsko aktivnost CYP1A2 so v študiji posredno merili preko detekcije luciferina. Encim CYP1A2 pretvori dodan substrat luciferin-1A2 v prekurzor luciferina, ki se s pomočjo D-cisteina (ki je prisoten v detekcijskem reagentu in dodan celicam) pretovri v luciferin, ki omogoči sistem za enostavno odčitavanje encimske aktivnosti. Pri identifikaciji miRNA sekvenc za regulacijo izražanja CYP1A2 so v študiji s pomočjo osnovnih pravil in navodil za načrtovanje miRNA najprej skonstruirali 5 različnih sekvenc, ki ciljajo CYP1A2 (miR-30a-C). Na podlagi teh so osnovali miRNA stikala, ki so bila zaradi dodane sekvence aptamera odzivna na teofilin (miR-30a-CT). Nadalje so iz podatkovnih baz miRbase in miRWalk Version 3 pridobili v naravi že obstoječo miRNA (miR-378a) in jo z integracijo sekvence aptamera v osrednji del modificirali v miRNA stikalo (miR-378a-CT).
Utišanje izražanja CYP1A2 z miRNA
Po vzpostavitvi optimalnega izražanja encima CYP1A2 v uporabljenih HEK-293 celični liniji so preučevali sposobnost utišanja izražanja s strani prej opisanih miRNA sekvenc. 3 od 5 načrtovanih miRNA (miR-30a-C-45, 325 in 544) so uspele statistično značilno znižati luminiscenčno aktivnost (na od 38 % do 51 % preostanek aktivnosti). Prav tako se je izkazal, da že v naravi obstoječa miRNA (miR-378a) statistično značilno zniža aktivnost encima CYP1A2 (27 % preostanka luminiscenčne aktivnosti v primerjavi z ne utišano aktivnostjo). S tem so potrdili uspešnost sistema za načrtovanja miRNA s pomočjo baz podatkov, ki hranijo sekvence v naravi obstoječih miRNA. S tem se v prihodnje želi nadomesti načrtovanje več različnih sintetičnih miRNA z identifikacijo le ene, v naravni že prisotne miRNA.
Kontrola sinteze encima CYP1A2 z miRNA stikali, ki se odzivajo na toksin
Za nadaljnjo raziskavo določanja učinkovitosti miRNA stikal (miR-30a-CT in miR-378a-CT), ki se odzivajo na teofilin, sta bili izbrani 2 sekvenci miRNA, ki sta najučinkoviteje utišali izražanje CYP1A2 (miR-30a-C-325 in miR-378a-C). Z različnimi koncentracijami teofilina (0-10 mM) so preko znotrajcelične aktivnosti encima odstranjevalca ocenili sposobnost regulacije z miRNA stikali. Pričakovano so se na prisotnost teofilina odzvala samo miRNA stikala z integrirano sekvenco aptamera za teofilin (miRNA-CT) in inducirala encimsko aktivnost CYP1A2, ki je bila merjena preko luminiscence. V odsotnosti teofilina so miRNA stikala prav tako pričakovano povzročila nižjo aktivnost encima odstranjevalca (preostala aktivnosti 36 % - 40 % ). V prisotnosti teofilina so opazili statistično značilno povečanje (1,8 x) aktivnosti encima CYP1A2 v celicah, ki so vsebovale miRNA s sekvenco aptamera za teofilin (miR-30a-CT) v primerjavi s celicami z miRNA brez sekvence za aptamer (miR-30a-C).
Časovno odvisna kontrola izražanja CYP1A2
Po vzpostavitvi aktivacije CYP1A2 z miRNA stikalom so v študiji raziskali dinamične lastnosti izbranih stikal. Celice s plazmidi z miRNA stikali so 2 dni inkubairali v prisotnosti 2 mM teofilina, da so teofilin odzivna miRNA stikala prešla v vklopljeno stanje (angl. on). Sledila je odstranitev teofilina in ponovno 2 dnevna inkubacija, da so stikala prešla v izklopljeno stanje (angl. off). Po odstranitvi teofilina je prišlo do znižanja izražanja encima odstranjevalca, kar dokazuje, da so uporabljena miRNA stikala reverzibilna. Večje znižanje encimske aktivnosti (- 29 %) je bilo opaženo pri uporabi naravno prisotne miRNA (miR- 378-CT) v primerjavi s sintetično načrtovano miRNA (miR-30a-CT) (- 11 %).
Zaključki
V opisani študiji so dokazali, da lahko izvajajo kontrolo izražanja encimov odstranjevalcev z uporabo regulatornega sistema na osnovi miRNA stikal, ki se odzivajo na prisotne toksine. Rezultati prikazujejo, da postranskripcijska regulacija genov z miRNA stikali lahko producira detoksifikacijsko funkcijo, ki temelji na znotrajceličnem molekularnem dogodku. Predvidevajo, da ima imenovana detoksifikacijska funkcija v prihodnosti lahko širok spekter uporabe; v personalizirani medicini, spremljanju stanja v okolju, obrambi pred onesnaženjem ...
Kontrola izražanja genov na molekularnem nivoju je ključno orodje za bioračunalništvo in bioinformatiko in z miRNA stikali inducirana translacijska kontrola predstavlja dober sistem za izvajanje takšnega nadzora pri evkariontih. Prednost programiranja celičnih funkcij z omenjenim sistemom je predvsem v hitrem odzivnem času na zunanje signale (npr. toksine).
Znano je, da so sekundarne strukture - zanke na koncih miRNA – ključne za regulacijsko delovanje molekule. V študiji so se zato odločili, da sekvenco aptamera za teofilin vstavijo v osrednji del miRNA in se s tem izognejo poseganju v ohranjeneno območje končnih zank. Dodatek male molekule, v tem primeru teofilina, onemogoči kasnejše procesiranje in obdelavo miRNA. Domnevajo, da je to posledica strukturnih sprememb, ki onemogočijo obdelavo s strani encimskih kompleksov Drosha in Dicer, kar prepreči nastanek kompleksa RISC z zrelo miRNA.
Omenjen sistem, ki temelji na miRNA, lahko v vklopljenjem stanju (angl. on) spodbudi izražanje genov blizu njihovega maksimuma izražanja, medtem ko v izklopljenem stanju (angl. off) prihaja do ti. puščanja, kar se kaže v večjem ali manjšem izražanju genov, ki ni enak ničelnemu izražanju. V primeru umetno vgrajenega stikala, ki se odziva na teofilin in pomaga pri detoksifikaciji pacienta, bi se to kazalo v določenih koncentracijah encima CYP1A2, sintetiziranega v neaktivnem oz. izklopljenem stanju stikala, kar v študiji imenujejo puščanje (angl. leakage). Te majhne koncentracije bi sicer lahko okrepile naravno aktivnost encimov naddružine citokromov P450 v jetrih. V primeru, da bi bil pacient zaradi nujnega zdravljenja astme izpostavljen toksičnim koncentracijam teofilina [> 100 μM], bi se vgrajeno stikalo aktiviralo in povečalo detoksifikacijsko funkcijo in poskreblo za hitrejše razstrupljanje telesa.
Rezultati študije so potrdili, da je evolucijsko zasnovana miRNA (ta, ki je v naravi že prisotna) pri encimski aktivaciji v prisotnosti induktorja (v obliki toksina) učinkovitejša kot sintetično načrtovane različice miRNA. Iskanje že obstoječih in v naravi prisotnih miRNA je preposto, saj temelji na brezplačnih spletnih bazah podatkov in orodjih za predikcijo. miRNA-378a, ki je bila iz baz podatkov izbrana v tej raziskavi, je med različnimi vrstami sesalcev zelo ohranjena (vključno z ljudmi, mišmi in podganami) in bi zato moral delovati v različnih sesalčjih celicah. V članku predvidevajo, da naj bi sistem miRNA stikal deloval pri vseh vrstah, ki posedujejo nujne encimske in neencimske komponente za obdelavo miRNA, kot sta npr. encima Drosha in Dicer (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).
Viri
Dalchau, Neil idr. 2018. „Computing with biological switches and clocks“. Natural Computing.
Gong, Li Li, Li Da Du, in Guan Hua Du. 2018. „Theophylline“. V Natural Small Molecule Drugs from Plants,.
Mccown, Phillip J. idr. 2017. „Riboswitch diversity and distribution“. RNA.
Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.
