Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin

UVOD

Uporaba fagov za boj proti bakterijskim boleznim rastlin, je zanimivo področje, ki kaže velik potencial. Trenutni nadzorni ukrepi, ki vključujejo uporabo tradicionalnih kemikalij ali antibiotikov, izgubljajo svojo učinkovitost zaradi naravnega razvoja odpornosti bakterij na ta sredstva. Poleg tega se povečuje zavedanje, da je njihova uporaba okolju škodljiva. Zato so bakteriofagi v zadnjih letih deležni vse večjega raziskovalnega zanimanja, kot okolju prijazno sredstvo za nadzor nad bakterijskimi boleznimi rastlin. Fage se lahko učinkovito uporablja kot del celostnih strategij za obvladovanje bolezni. Zaradi relativne enostavnosti priprave zdravljenja ter nizkih stroškov proizvodnje teh sredstev, so dobri kandidati za široko uporabo, tudi v državah, ki so v razvoju. Vendar pa je učinkovitost fagov, kot velja za številna biološka sredstva za nadzor, močno odvisna od prevladujočega okolja dejavnikov, kot tudi na dovzetnost ciljnega organizma.

Bakterijske okužbe v agrikulturi

Bakterijski povzročitelji so povezani z rastlinskimi boleznimi v zmernem, subtropskem in tropskem okolju in lahko predstavljajo velike gospodarske izgube kmetijske proizvodnje. Nadzor nad boleznimi, ki jih povzročajo bakterije, je izziv. Glavni izzivi, ki so povezani z nadzorom bakterijskih okužb vključujejo:

raznolikost patogenov; nezmožnost prepoznavanja trajne odpornosti rastline gostiteljice na ciljni patogen; sposobnost patogena, da doseže visoko populacijo v razmeroma kratkem času, ko so pogoji za razvoj bolezni; pomanjkanje učinkovitega kemičnega nadzora.

Za večino bolezni rastlin, vključno z bakterijskimi boleznimi, je nujna celovita strategija upravljanja, ki združuje ustrezen biološki nadzor in baktericide.

Biološka kontrola

Biološki nadzor je zaželena strategija za obvladovanje bolezni rastlin, pri kateri se nepatogeni mikroorganizmi nanesejo na liste ali korenine, kar povzroči zatiranje bolezni. Strategije za uporabo biološkega nadzora za bakterijske bolezni vključujejo uporabo nepatogenih ali patogeno altuliranih sevov patogenov mikroorganizmov, nepatogenih bakteriiocinov, ki proizvajajo bakterijo Agrobacterium radiobacter, ki zavira rast spodbujajočo rizobakterijo za zatiranje populacij patogenov ali induciranje SAR ali podobnega odziva v rastlini, ki zmanjšuje sposobnost patogena, da kolonizira rastlino in povzroči bolezen. Ti pristopi k biološkemu nadzoru so dosegli različne stopnje uspešnosti in zahtevajo dodatne raziskave za izboljšanje njihove zanesljivosti v terenskih pogojih.

Zgodnja uporaba bakteriofagov v agrikulturi

Za odkritje bakteriofagov sta zaslužena mikrobiologa Frederick Twort (Twort, 1915) in Felix d'Herelle. Zelo zgodaj po njihovem odkritju, je bil namen njihove uporabe kot zaviralci bolezni pri ljudeh in živalih. Kmalu zatem pa so našli tudi povezavo med bakteriofagi ter bakterijskimi patogeni v rastlinah ter jih predlagali kot sredstva za zatiranje rastlinskih bolezni. Mallman in Hemstreet, sta bila pionirja na področju, ki sta leta 1924 odkrila, da filtrat tekočine, zbrane iz razpadajočega zelja, zavira rast bakterije Xanthomonas campestris pv. campestris, ki povzroča gnilobo.

Izzivi uporabe bakteriofagov

Čeprav se je v zgodnjih fazah uporabe bakteriofagov pokazalo uspešno zatiranje bakterijskih bolezni rastlin, fagoterapija ni izpolnila svoje obljube in se ni spremenila v praktično antibakterijsko strategijo za nadzor rastlinskih patogenih bakterij, zaradi težav z učinkovitostjo in zanesljivostjo. Eden vodilnih na tem področju, Okabe, je leta 1963 zaključil, da se zdi, da so fagi na splošno neučinkoviti kot nadzorna strategija. Poleg tega je njihov ozek spekter delovanja proti določenim bakterijskim vrstam postavljal fage v slabši položaj pred drugimi antibakterijskimi materiali, kot je npr. antibiotiki, ki so imeli bolj širok spekter delovanja.

Na uspešnost vsakega posameznega biokontroliranja vplivajo gostota agentov in tarč. V primeru fagne terapije je ključno, da fag pride v stik s svojim gostiteljem, preden je uničen in verjetnost stika fag-bakterija je odvisna od več dejavnikov:

začetna fagna koncentracija; hitrosti propadanja viriona; sposobnost razmnoževanja fagov v ciljnem okolju; koncentracija in lokacija ciljnih bakterij; prisotnost ustrezne vode kot gojišča za difuzijo fagov.

Poleg tega lahko na učinkovitost zatiranja bolezni vpliva čas aplikacije oz. uporabe faga, na fage odporni bakterijski mutanti ter okoljski dejavniki. Fagi se uporabljajo za nadzor patogenih rastlin bodisi v rizoferi ali filosferi.

Ugotovljenih je bilo več dejavnikov, ki lahko ovirajo uspešen nadzor bolezni v rizosferi. Nizka hitrost difuzije skozi raznoliko matrico tal, ki se spreminja s spremembo količine vode v zemlji. Prav tako se fagi lahko ujamejo v biofilme, reverzibilno adsorbirajo na delce zemlje, kot npr. glina ter se inaktivirajo zaradi nizkega pH prsti.

Zaradi nizkih stopenj difuzije in visokih stopenj inaktivacije fagov, je na koncu na voljo le majhno število fagov za liziranje ciljnih bakterij. Dodatna težava je potreba po visokih populacijah fagov in bakterij, da se začne verižna reakcija bakterijskega liziranja. Filosfera je zelo neugodno okolje za fage in posledično se, ko so nanešeni na listne površine razgradijo izredno hitro. To je tudi glavni omejajoči dejavnik, za uporabo fagov za zdravljenje v filosferi. Terenske in laboratorijske študije so pokazale, da se virusi inaktivirajo ob izpostavljenosti visoki temperaturi, visokemu in nizkemu pH in pri direktni sončni svetlobi. Najbolj uničujoč okoljski dejavnik je bil UV-A in UV-B spekter sončne svetlobe (280–400 nm). To so dokazali z poiskusih na rastlini paradižnika. Ko je bil uporabljen fag v sredi dopoldneva, nadzor nad bakterijsko okužbo rastline paradižnika ni bil dosežen. V poskusu so bili fagi, ki so bili nanešeni na liste rastline paradižnika in so bili izpostavljeni sončni svetlobi, odtsranjeni iz filosfere le nekaj ur po njihovem nanosu.

V rastlinjakih, kjer ni direktne izpostavljenosti sončni svetlobi, lahko fagi preživijo do enega tedena. Tudi temperatura lahko vpliva na življenjsko dobo fagov ter njihovo sposobnost liziranja bakterij. Prav tako nizek pH ovira nadzor bolezni z inaktivacijo fagov. Slednje je bilo potrjeno v študiji, kjer so bili fagi na rezinah jabolka zelo nestabilni, zaradi nizkega pH na površini ( pH 4,37), medtem ko so bili stabilni na rezinah melone, ki so imele sorazmerno visok pH (površinski pH 5,77). Pokazalo se je občutno zmanjšanje populacije Listeria monocytogenes na melonah, ne pa na jabolkah. Fagi lahko tudi pridejo v stik z velikim številkom različnih pesticidov na rastlinskem listju. Čeprav večina kemikalij ne vplivajo na obstojnost faga, so bakrove spojine škodljive za njegov obstoj, v primeru, da jih nanesemo manj kot 3 dni pred obdelavo z fagi. Raziskanih je bilo več pristopov za povečanje učinkovitosti bionadzora v filosferi s povečanjem dolgoživosti faga, vključno z uporabo zaščitnih formulacij; z uporabo bakterij kot nosilcev za razmnoževanje fagov v ciljnem okolju; z uporabo fagov, ki so bolje prilagojeni v ciljno okolje in uporabo fagov zvečer ali zgodaj zjutraj.

Primer uporabe bakteriofagov

Pseudomonas syringae je gram negativna bakterija in je glavni povzročitelj bolezni pri najrazličnejših sadnih drevesih. Najpogostejša oblika zdravljenja je z antibiotiki in bakrovimi razprševalci, vendar pa se je potrebno tem zdravljenjem izogibati zaradi velike strupenosti za okolje in spodbujanja bakterijske odpornosti. Fagna terapija je lahko koristno alternativno orodje za zatiranje bakterije, saj se fagi razmnožujejo eksponentno glede na bakterije, njihovo število pa se manjša glede na zmanjšanje št. bakterij.

Fag φ6 je eden najbolj preučenih in komercialno dostopnih fagov. Zanj velja, da naj bi bil učinkovit za zatiranje z bakterijo Pseudomonas syringae, prav tako pa lahko zatira še druge bakterije, ki so fito patogene za kmetijski sektor. Fag φ6 je lahko potencialno uporabljen ne le pri citrusih, ampak tudi pri slivah, češnjah, marelicah itd. Ker je območje tega faga precej ozko, na zdravljenje ne bodo vplivale naravne nepatogene bakterije okuženih rastlin. Pokazalo pa se je, da fag spreminja območje gostitelja z mutacijami v proteinih, ki vežejo receptorje. Fag se uspešno razmnožuje v patogeni bakteriji vendar zato potrebuje čas (učinek se pojavi šele po 10h inkubacije).

Odmerki fagov za zdravljenje niso bistveni, prav zaradi njihove narave in to je ena izmed prednosti fagnega zdravljenja rastlin pred zdravljenjem z antibiotiki. Pri pregledu učinkovitosti faga φ6 so tudi ugotovili, da le ta ni dokončno iz rastline odstranil patogene bakterije, saj so bile nekatere proti temu fagu odporne. Nekatere študije so tudi to trditev dokazale.

Za uspešno zdravljenje rastlin s fagom je zelo pomembno okolje, saj na delovanje pomembno vplivajo pH, temperatura in UV svetloba. Temperatura ima ključno vlogo pri pritrditvi in prodiranju faga v gostititeljsko celico. Največji vpliv ima sončno sevanje, saj lahko le-to neposredno vpliva na proste viruse z razgradnjo beljakovin in spreminjanjem strukture. Visoke valovne dolžine povročajo nepopravljive poškodbe genomskega materiala.