Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih

Uvod

Vsakodnevno ljudje po celem svetu kupujejo in uživajo razna živila rastlinskega in živalskega izvora v dobri veri, da so živila varna in ne vsebujejo patogenih baterij. Ampak vsako leto na milijone ljudi zboli zaradi okužbe z raznimi patogeni, ki so jih zaužili s hrano. Torej patogene bakterije so prisotne v hrani, ki jo kupujemo in predstavljajo problem s katerim se spopada prehrambena industrija. Pojav rezistence bakterij na enega ali celo več antibiotikov ( t.i. multidrug-resistant bacteria) in pa sprememba v odnosu potrošnikov do kemijskih aditivov in težnja po čim bolj naravni hrani, obdelani s čim manj kemikalijami je spodbudila razvoj novih alternativnih sredstev proti bakterijam.

Možno rešitev tega problema predstavljajo bakteriofagi. Nahajajo se tako v naravnih kot v umetnih okoljih in kot virusi, ki uporabljajo bakterijske celice za svoje razmnoževanje, predstavljajo naravne sovražnike bakterijam.

Prednosti uporabe bakteriofagov

Za uporabo v boju proti bakterijam v živilih imajo bakteriofagi določene prednosti:

• Visoka specifičnost: bakteriofagi katerih tarča so patogene bakterije in bakterije, ki povzročajo kvarjenje hrane ne ogrožajo naravne mikrobiote gastrointestinalnega trakta;

• Zmožnost samorazmnoževnaja: že majhna doza bakteriofagov se je zmožna razmnožiti ob prisotnosti gostiteljskih bakterij in ko gostiteljskih bakterij ni več se tudi razmnoževanje ustavi;

• Zmožnost adaptacije: tako, kot so se zmožne bakterije prilagoditi in razviti obrambne mehanizme proti bakteriofagom, so tudi oni zmožni adaptacije na te spremembe;

• Odpornost: bakteriofagi so močno odporni na stres ki ga prinese predelava hrane;

• Do sedaj še niso opazili negativnih efektov, ki bi jih imeli bakteriofagi na evkariontske celice;

• Ne spremenijo zaznavnih lastnosti hrane, kot so okus, vonj in videz;

Poleg tega so bakteriofage izolirali iz raznih surovih živil (npr. govedina, perutnina), procesiranih živil, fermentiranih produktov (npr. jogurt, sir) in morske hrane. Kar pomeni da jih ljudje že dnevno zauživamo.

Uporaba bakteriofagov

V namen boja proti bakterijam v živilih se striktno uporabljajo samo litični bakteriofagi, saj je namen odstraniti bakterijske celice. Bakteriofage se v glavnem uporablja na štirih stopnjah tekom pridelave in predelave hrane. In sicer:

• Med primarno produkcijo: z dodatkom bakteriofagov preprečimo bakterijske okužbe med gojenjem rastlin in živali;

• Med procesiranjem: s tem preprečimo razvoj bakterijskih kolonij tekom procesiranja hrane;

• Pri sanitaciji: za čiščenje površin, ki pridejo v stik z živili tekom procesa;

• Pri konzervaciji: preprečevanje kontaminacije in razmnoževanja patogenih bakterij med shranjevanjem živil.

Uporaba bakteriofagov pri pridelavi rastlin

Sposobnost kmetijstva da kontinuirno oskrbuje prebivalstvo z dovoljšno količino hrane je ključnega pomena. Bakterijske okužbe rastlin predstavljajo eno od ovir, ki to onemogočajo. Do sedaj je bilo izvedenih že veliko študij, ki potrjujejo učinkovitost bakteriofagnih koktajlov proti številnim bakterijam, ki okužijo rastline, kot so na primer: Erwinia spp., Xanthomonas spp., Pseudomonas syringeae pv. phaseolicola in Ralstonia solanacearum.

Za uporabo bakteriofagov v boju proti bakterijskim okužbam v kmetijstvu se je potrebno spopasti z določenimi problemi. Potrebno je razviti način efektivne terapije z bakteriofagi za hektare obdelovalnih površin. Upoštevati je treba, da so v takih odprtih okoljih patogeni konstantno prisotni in dejavniki kot so veter, voda in insekti ves čas vnašajo nove patogene. V upoštev je treba vzeti razne pesticide, ki se jih v kmetijstvu uporablja, ki imajo lahko negativen vpliv na bakteriofage. Problem predstavljajo tudi razni klimatski dejavniki, kot so nihanje temperature, suša, UV sevanje.

V raziskavi so primerjali učinkovitost bakteriofagov proti bakteriji Xanthomonas campestris pv. pruni na plodovih nektarin v kontroliranih klimatskih pogojih in v sadovnjaku. Čeprav je 92 % sadja ostalo zdravega, so opazili da je bilo zmanjšanje populacije bakteriofagov v sadovnjaku za 10^4 večje. Možna razlaga za tako zmanjšanje populacije v naravnem okolju je povišana temperatura, dehidracija in UV sevanje.

V nadaljnjih študijah so se zato še posebej posvetile vplivu okoljskih dejavnikov. Ugotovili so da suspenzija bakteriofagov v bakteriofagov v 0,75% raztopini posnetega mleka v prahu ali pa 0,5% procentne saharoze, pomaga pri preživetju fagov v boju proti Xanthomonas spp. pri paradižniku. Obe mešanici sta pomagali pri blaženju vpliva UV sevanja. Trenutno potekajo še dodatne raziskave o potencialnih faktorjih, ki bi bili zmožni zmanjšati negativni efekt UV sevanja.

Uporaba bakteriofagov pri živinoreji

Večino dosedanjih študij zdravljenja živali z bakteriofagi se je izvajalo na štirih skupinah živali: perutnini, govedu, ovcah ter prašičih. Študije na kokoših so pokazale, da so terapije z bakteriofagi obetavne pri zmanjševanju patogenih bakterij v vzorcih vzetih iz slepega črevesa živali. Ena študija vpliva mešanice bakteriofagov na količino bakterij Campylobacter jejuni je pokazala začetni upad za 3 log CFU(Colony Forming Units)/g v primerjavi z kontrolno skupino in po 5 dneh se je količina nekoliko stabilizirala in bila za 1 log CFU/g manjša od kontrolne skupine. Poleg efektivnosti administracije bakteriofagov po infekciji so opazovali tudi skupino v katero so preventivno vnesli bakteriofage. Opazili so, da je prvotna kolonizacija črevesja opočasnjena, a se je po tednu dni stabilizirala in bila primerljiva skupini z post infekcijsko terapijo.

Za zmanjšanje količine Salmonella enterica pri prašičih med transportom in pred zakolom so uporabili koktajl bakteriofagov. Opazili so zmanjšanje kontaminacije črevesja prašičev za 90-95% v primerjavi z kontrolno skupino.

Ideje za aplikacije bakteriofagov niso omejene samo na kopenske živali, ampak se raziskuje tudi različne načine za administracijo bakteriofagov preko hrane za ribe. Težava pri tem je sproščanje bakteriofagov s hrane v slano vodo. Rešitev tega problema bi lahko predstavljali premazi iz biopolimerov, ki bi zaustavili uhajanje bakteriofagov.

Faktorji, ki vplivajo na efektivnost delovanja bakteriofagov

Študije na živilih kažejo na to, da na efektivnost delovanja bakteriofagov vpliva več faktorjev (koncentracija fagov, lastnosti matriksa, kje in kdaj v proizvodnem postopku se dodajo bakteriofagi, izbira bakteriofaga, način aplikacije).

Višja koncentracija bakteriofagov ponavadi privede do večjega zmanjšanja bakterij. Vendar ni vedno mogoče ali ni ekonomsko smiselno uporabljati visoke koncentracije fagov. Prav tako lahko tudi nižje koncentracije privedejo do zaželenih rezultatov, npr. pri kokoših, ki so bile okužene z patogenimi E. coli je pri naravnem izbruhu bakterij že nižja koncentracija bakteriofagov znatno znižala umrljivost.

Ko dodajamo bakteriofage živilom je precej pomembno kakšne so lastnosti matriksa tega živila, ker te lahko vplivajo na efektivnost bakteriofagov. Pri raziskavi, kjer so primerjali efektivnost fagov v polnomastnem mleku, posnetem mleku, energijski pijači, jabolčnem soku in surovem tekočem jajcu so opazili najmanjšo efektivnost pri jajcu. Predvidevali so, da je efektivnost zmanjšala velika viskoznost jajca in s tem omejila difuzijo bakteriofaga.

Način s katerim apliciramo bakteriofage močno vpliva na efektivnost. Pogosto se uporablja razprševanje, a se pri tem v okolje vnese tuje bakteriofage in spiranje opreme ni vedno mogoče. Najboljše rezultate pri živalih kažejo eksperimenti, kjer se koktajl bakteriofagov vnese oralno v žival, pri tem pa je pomembno, da pazimo na prebavne poti in ustrezno zaščitimo bakteriofage. Za zaščito pred nizkim pH-je v želodcu se poleg bakteriofaga vnese tudi antacid ali pa se enkapsulira bakteriofag.

Enkapsulacija bakteriofagov

Enkapsulacija bakteriofagov v specifične ovoje omogoči kontrolo nad sproščanjem bakteriofagov, ko so izpolnjeni pravi pogoji. Načinov kako se bakteriofage enkapsulira je veliko in še vedno se razvijajo novi postopki.

Pogost način zaščite bakteriofagov, ki se vnašajo s hrano in vodo je enkapsulacija v kapsule, ki so narejene iz alginata ter obdane z različnimi polimeri. Za močnejšo strukturo alginatnega hidrogela se zraven dodaja hitozan, izolat sirotke ali ksantan gumi. Takšen postopek je bil prvič omenjen leta 2008, ko so raziskovalci enkapsulirali za Salmonella specifičen bakteriofag FelixO1 v kapsule iz alginata obdane z hitozanom. Zaradi te predelave so bakteriofagi delno obdržali svojo aktivnost, ko so bili dani v simulirano želodčno kislino, a se je čas sproščanja bakteriofagov podaljšal na 5 h.

Pri enem od že patentiranih načinov enkapsulacije so bakteriofage imobilizirali v prahu posnetega mleka in vse to zaprli v kapsulo narejeno iz palmitinske in stearinske kisline. Bakteriofagi v takšnih kapsulah so bili bolj odporni na pH 2,15 kot kontrolna skupina bakteriofagov.

Uporaba bakteriofagov in encimov, ki se prenašajo s fagi, v procesu sanitacije površin v prehrambni industriji

Tvorba mikrobioloških biofilmov na površinah opreme je ena glavnih težav v obratih za proizvodnjo hrane. Biofilm je vsak skupek mikroorganizmov, v katerem se celice pritrjene ena na drugo in pogosto tudi na neko površino (biotsko ali abiotsko). Te celice se obdajo z sluzastim zunajceličnim matriksom, sestavljenim iz zunajceličnih polimernih snovi (EPS). Celice v biofilmu proizvajajo komponente EPS, ki je običajno konglomeracija zunajceličnih polisaharidov, beljakovin, lipidov in DNA.

Za bakterijske celice (L. monocytogenes, Salmonella, E. coli, Yersinia), ki tvorijo biofilme, je značilna visoka odpornost na neugodne okolijske razmere, antibiotike in razkužila. Biofilmi so dinamične strukture, katerih dovzetnost za bakteriofage je odvisna od vrste bakteriofaga in njegove sposobnosti proizvajanja encimov, ki lahko uničijo biofilm, ter od razpoložljivosti receptorskih mest za fage.

Velik potencial za boj proti bakterijskim biofilmom imajo encimi bakteriofagov (depolimeraze in endolizini). Depolimeraze (DP) lahko razgradijo strukturne, kapsularne in zunajcelične polisaharide, da olajšajo adhezijo fagov na celice. Depolimeraze se lahko pojavijo kot sestavni deli fagov ali kot topni proteini. Depolimeraze delimo na hidrolaze (polisaharaze) in liaze.

Uporaba endolizinov bakteriofagov pri konzerviranju hrane

Druga vrsta encimov, ki imajo potencialno uporabo v biosanitizaciji so endolizini. Uporabljajo se lahko eksogeno za uničenje gram-pozitivnih bakterij. Da so endolizini bolj učinkoviti proti gram-negativnim bakterijam je treba zunanjo membrano permeabilizirati (npr. z jabolčno in citronsko kislino). Določeni endolizini imajo povečano antimikrobno delovanje v prisotnosti Ca2+ in Mn2+.

Uporaba endolizinov bakteriofaga je mogoča na različnih stopnjah pridelave in predelave hrane. Učinkovitost endolizinov se poveča pri obdelavi hrane pri visokem hidrostatičnem tlaku. Druga obetavna metoda vključuje uporabo rekombinantnih bakterij, ki izločajo endolizine. Do danes niso našli nobenih sevov odpornih na endolizin. Za bakterije je razvoj odpornosti proti endolizinom težaven, saj bi ti organizmi morali spremeniti strukturo svoje celične stene.

Dvojna narava bakteriofagov v mlečnem sektorju

Bakteriofagi lahko zaradi svoje prisotnosti prispevajo k velikim finančnim izgubam v industriji. V mlečni industriji bakteriofagi (Caudovirales, Podoviridae in Siphoviridae) uničijo fermentacijski proces z lizo mlečnokislinskih bakterij (LAB).

Zmerni fagi integrirajo svoj genetski material v gostiteljski genom in ta se prenese na potomce. V življenjskem ciklu faga lahko zmerni bakteriofag LAB ostane dlje časa v obliki profaga. Stres, povezan s predelavo hrane, lahko aktivira profage in sproži litični cikel in s tem smrt LAB.

Obstaja veliko virov za fagno kontaminacijo fermentiranih izdelkov, ki vključujejo surovo mleko in sirotko v prahu. Surovo mleko je naravni rezervoar LAB, zato ima lahko bakteriofage, specifične za LAB. Začetne kulture LAB so tudi lahko vir okužbe z bakteriofagi. Drugi pomembni viri onesnaženja z bakteriofagi so zrak in površina v mlekarnah.

Bakteriofagi so pa lahko tudi koristni v mlečni industriji. Zaradi visoke specifičnosti se fagi lahko uporabljajo za uničenje patogenov, na primer bakterije Staphylococcus, ki jih pogosto najdemo v mlečnih izdelkih. Vseeno pa je določeno tveganje, da fermentacija ne uspe, kar zmanjšamo z:

• Uporabo učinkovitih razkužil (natrijev hipoklorit)

• Rotacijo sevov (sirarne)

• Genski inženiringom - izgradnja na fage odpornih sevov LAB

Detekcija fagov v mlečnih izdelkih

Za detekcijo se uporabljajo klasične mikrobiološke metode, na primer preizkus s plaki ali spremljanje zakisanosti. V surovem mleku je mogoče uporabiti tudi molekularno biološke metode - qPCR in klasični PCR. Metoda qPCR temelji na fluorescentnih tehnikah in omogoča hitrejšo detekcijo kot PCR. Dodatna metoda je pretočna citometrija, kjer spremljamo fizikalne in kemijske lastnosti populacije celic, njihovo množično odmrtje.

Viri

• M. Połaska and B. Sokołowska, “Review bacteriophages—a new hope or a huge problem in the food industry,” AIMS Microbiology. 2019.

• R. Lewis and C. Hill, “Overcoming barriers to phage application in food and feed,” Current Opinion in Biotechnology. 2020.

• E. Parente, T. M. Cogan, and I. B. Powell, “Starter Cultures: General Aspects,” in Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology: Fourth Edition, 2017.

• Maddocks, Sarah, and Rowena Jenkins. “Quantitative PCR.” Understanding PCR. 2017.

• A. Svircev, D. Roach, and A. Castle, “Framing the future with bacteriophages in agriculture,” Viruses. 2018.