Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh

Začetki zdravljenja z bakteriofagi

Bakteriofagi so bili odkriti približno 100 let nazaj. Leta 1915 jih je odkril Frederick W. Twort v Londonu, leta 1917 pa Félix d'Hérelle v Parizu. Kmalu po njegovem odkritju je d'Hérelle začel raziskovati uporabo bakteriofagov za zdravljenje nalezljivih bolezni pri živalih. Preučeval je bakterijo imenovano Pasteurella pri vodnih bivolih, salmonelo pri piščancih in bakterijo imenovano Shigella pri zajcih. Ker so bili rezultati obetavni se je odločil preizkusiti zdravljenje na ljudeh. Leta 1921 je poročal o uspešnem zdravljenju hude okužbe otrok z bakterijo Shigella. Bakteriofagna terapija se je v Franciji klinično izvajala vse do leta 1990.

Najbolj pomembne raziskave bakteriofagne terapije izvedene na živalih pa segajo nazaj v osemdeseta leta. Smith in njegovi kolegi so raziskovali terapevtsko uporabo bakteriofagov pri mladih živalih na kmetiji. Predvsem so se osredotočili proti bakterijskim okužbam, ki povzročajo diarejo. Rezultati so bili spodbudni, saj so okužbe zaradi peroralne inokulacije zmesi šestih patogenih sevov E. coli ozdravili z dajanjem enega odmerka 10^5 fagnih delcev, ki so bili aktivni proti njimi. Nižji odmerek (10^2) pa je bil dovolj za preprečevanje diareje. Zanimivo je dejstvo, da so vse potrebne bakteriofage za zdravljene dobili iz odpadne vode.

Novejše raziskave zdravljenja živali z bakteriofagi

Nekaj novejših raziskav (novejših v smislu po letu 2000) je obravnavalo okužbo psov z baterijo P. aeruginosa. Vse so potrdile pozitiven vpliv bakteriofagne terapije, ampak zaradi pomanjkanja točnih informacij o tem, kateri bakteriofagi so bili uporabljeni, so za dejansko zdravilo potrebne dodatne raziskave.

Izvedena je bila tudi raziskava infekcije E.coli pri govedu in prašičih. Naredili so poskus na E.coli pri prašičih, kjer so uporabili T4 fag iz družine Myoviridae. Zagotavljal je 100% zaščito v vseh odmerkih; optimalni odmerek je bil določen kot trojno zdravljenje s 10^9 fagov pri enomesečni prašičih. Izvedeni so bili tudi poskusi na teletih in jagnjetih, peroralno okuženih s 3x10^9 E. coli tipa O9: K30.99.57 in noben od 9 telet, ki so bili zdravljeni z odmerkom 10^11 fagov ni dobil obolenj, v primerjavi s kontrolno skupino, kjer je umrlo 93% telet. Fagi sicer niso mogli uničiti E. coli v celoti, so pa lahko zmanjšali količino bakterij na raven pod patogeni prag.

Ena izmed novih raziskav je bila tudi tretiranje Vibrio cholerae pri zajcih. V poskusu so testirali 10 fagov (B1 - B10) (10^10 - 10^11 fag / ml) proti V. Cholerae z uporabo in vivo modela zajcev. Injicirali so jih skupaj s 10^8 CFU ATCC 51352 V. Cholerae v zajčevo črevesje; vendar ni bilo zaznanega niti antibiotičnega niti terapevtskega učinka v nasprotju z uspešnim zdravljenjem fagov za kolero pri človeku. Raziskovalci domnevajo, da bi se to lahko zgodilo, ker bi nekatere komponente v zajčjem črevesju zavirale fagno aktivnost.

Zadnja izmed novejših raziskav, ki bi jo omenil pa je bila namenjena tretiranju miši okuženih z bakterijo Enterococcus faecium. Fagna terapija je bila preizkušena na vankomicin odpornem Enterococcusu na miših. Miši so okužili s 10^9 CFU enterococcus faecium. Enkratna intraperitonealna injekcija 45 min po bakterijski okužbi z 3x10^9 fagi je zaščitila vse miši. Ko so zdravljenje s fagi začeli šele, ko je bolezen dosegla vrh (18-24 ur po okužbi), so pred njo lahko rešili le 50% miši. V obeh primerih se je količina patogena v krvi znatno zmanjšala.

Splošno o terapiji z bakteriofagi

Za učinkovito antibakterijsko terapijo mora bakteriofag izpolniti nekaj pogojev: imeti mora selektivnost za tarče, torej infecirati mora patogene bakterije, medtem ko drugih, komenzalnih, ne sme. Preživeti mora pot od oralne aplikacije do črevesja. Na replikacijskem mestu patogena mora ostati dovolj dolgo in v dovolj velikem številu, da lahko doseže svojo litično aktivnost. Še posebej pomembno pa je, da ne povzroča stranskih učinkov, ter da ne nosi zapisa za virusna obolenja in rezistenco proti antibiotikom.

Čeprav vrstno specifičnost fagov jemljemo za prednost, je velikokrat problematična njihova previsoka specifičnost – specifičnost na seve – ki jih je v živalskih prebavilih veliko. Zato mora biti v koktejlu za terapijo proti E. coli veliko različnih vrst bakteriofagov

Problemu sevne specifičnosti dobro nasprotujeta seva ΦNUSA-1 in ΦNUSA-10, ki lahko infecirata >80% sevov MRSA in MSSA (na meticilin občutljiv Staphylococus aureus) od skupno 61 preizkušenih (25 MRSA in 36 MSSA).

Bakteriofagi in S. Aureus

Proti meticilinu odporni Staphylococcus aureus sev oz. MRSA, je po gramu pozitivna bakterija v obliki kokov. MRSA sevi so znani po tem, da se jih pogosto najde v bolnišnicah. MRSA ponavadi niso odporni samo na meticilin, ampak tudi na številne druge antibiotike. Povzročajo lahko življenjsko nevarne okužbe (pljučnica, okužbe krvi, okužbe na mestu operativnega posega), njihovo zdravljenje pa je bolj zapleteno od zdravljenja bolezni, ki jih povzročajo neodporne bakterije.

Še vedno proti njim delujejo glikopeptidna zdravila, naprimer vankomicin, ampak vedno več je tudi bakterij, ki so odporne proti tem antibiotikom – zato je pomemben razvoj bakteriofagnih terapij.

Okužbe s S. Aureus so problematine tudi pri prostetičnih sklepih. Povzroča okužbo teh sklepov in posledično oteklino in vnetje. Bakteriofagni koktejli so sposobni znižati količino bakterij v tkivu v okolici sklepa 5x, vankomicin pa 6,2x. Kombinacija obeh zdravil ima veliko močnejši učinek - število bakterij v tkivu okoli sklepa lahko zniža za kar 22,5x.

S. Aureus in MRSA povzročajo tudi okužbe kosti, oziroma osteomielitis. Trenutno je standard zdravljenja odstranjevanje okuženega tkiva in dolgotrajna antibiotična terapija. In vivo rezultati testiranja zdravljenja osteomielitisa z bakteriofagi zaenkrat še niso uporabni za terapijo, obstajajo pa dokazi, da je takšna terapija lahko uporabna pri zdravljenju okužb mehkih tkiv.

Uporaba bakteriofagov za prenos tovora v celice

Virusne delce je možno uporabljati kot izolirane znotrajcelične kompartmente z encimskimi funkcijami. Assembler plasmid P22 vsebuje gen za kapsidni protein in gen za ogrodne proteine, ki ga lahko spreminjamo. V raziskavi so O'Neil in sodelavci v klonirno mesto vstavili gene za fluorescirajoč protein in bakteriofage vstavili v E. Coli. Novonastali bakteriofagi so bili strukturno praktično nespremenjeni, razen s spremenjeno strukturo ogrodnih proteinov. S spreminjanjem gena za ogrodne proteine bi lahko v celice vnašali različne proteine, še posebej uporabni bi bili encimi pri spreminjanju procesov v organizmih, ker bi to lahko imelo terapevtske potenciale.

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa je bakterija, ki se pojavi pri različnih boleznih tako pri živalih kot tudi ljudeh. Ko govorimo o človeku, jo pogosto najdemo pri boleznih kot so pnevmonija (cistična fibroza), okužbah urinalnega trakta ter raznih okužbah na koži oziroma mehkem tkivu, kjer je prišlo do odrgnin ali opeklin ter razne razjede na koži. Glavna lastnost, ki ji daje zmožnost dolgotrajnega obstoja je odpornost na antibiotike in spada med MDS (multi-drugs resistance) bakterije.

Trenutno poteka veliko raziskav in-vivo na živalih, ter tudi in-vitro na človeških celicah. Zaenkrat je težko postaviti neko splošno hipotezo, kako zdraviti, saj obstaja več različnih sevov in v posameznih raziskavah tretirajo posamezne seve z določenimi bakteriofagi. Možnost zdravljenja raznih ran lahko poteka na različne načine kot so direktno na rano oziroma preko oralne zaužitve ali intravenoznega načina. Pri cistični fibrozi so trenutno v raziskave vključeni načini inhalacij aerosola skozi nos poleg oralnega zdravljenja, ter prav tako tudi potencialne suhe praške z bakteriofagi, ki so bolj obstojni in dlje časa zdržijo na mestu.

Obstajajo različni načini, kako lahko uničimo bakterije, ter različni obrambni mehanizme na katere vplivamo.

Obrambni mehanizmi

Med pomembnejšimi obrambnimi mehanizmi, na katere različne raziskave ciljajo so adherencijska inhibicija, ki onemogoči vezavo bakteriofaga na bakterijo, s tem ko pomaknejo receptorje v notranjost zunanje membrane zaradi spremembe pritiska ob vezavi.

Drugi pomemben mehanizem je CRISPR/Cas sistem. Bakterija vsebuje večkratno palindromsko zaporedje, z vmesnimi praznimi zaporedji, ki se ujema z nukleotidnim zaporedjem bakteriofagov. Ob prisotnosti bakteriofagov celica zazna to in začne sintetizirati to csRNA (crisper RNA), ki se nato prepisana poveže z Cas proteini. Ta kompleks se veže na encime bakterije in prepreči prepis dednega materiala bakteriofaga in s tem prepreči sintezo virusnih delov.

Načini zdravljenja

Eden izmed načinov zdravljenja je predčasno oziroma preventivno vbrizgavanje ustreznih bakteriofagov v organizem. Problem je v tem, ker težko napovemo kdaj se bo bolezen pojavila in o katerem sevu govorimo, vendar so v raziskavah potrdili, če bi poznali ta dva podatka bi bila ta metoda lahko zelo uspešna in uničila bakterije v prvi stopnji, ko poteka najbolj razširjeno razmnoževanje. S tem bi zelo olajšali bolezen.

Drugi način je istočasno zdravljenje z antibiotiki in bakteriofagi. Pri tem je poudarek na tem, da bakteriofag ob vezavi na bakterije sproži obrambni mehanizem in pri tem se bakterija obrani pred bakteriofagom, vendar je zelo občutljiva za ostale napade. Tako bi z dodatkom različnih antibiotiokov ti vstopili v bakterije in opravili svojo nalogo, brez da bi bakterija odgovorila nanje.

Primer za Pseudomonas aeruginosa so bakteriofagi OMKO1 (družina miovirusov), ki se vežejo na receptor OprM na zunanji membrani bakterije. Ta protein tvori skupaj s proteinoma MexA in MexB kanal skozi membrane za izločanje antibiotikov. Ob vezavi bakteriofagov pa se struktura tega kanalčka spremeni in izločanje antibiotikov je omejeno. Tako lahko ob istočasnem zdravljenjem antibiotiki neovirano delujejo, brez da bi jih bakterija izločila, saj se ne more braniti pred bakteriofagom in antibiotikom hkrati. Na ta način bi lahko že prej znani delujoči antibiotiki uničili bakterijo. Raziskovalci poznajo že nekatere obrambne mehanizme in delovanje bakterije Pseudomonas aeruginosa, vendar je težko zaenkrat izvajati kakšne resne poskuse in-vivo na človeku, saj je lahko veliko stranskih kaskad in prilagajanj, ki še niso znana in specifike posameznih sevov, vendar je kljub temu zelo potencialen način zdravljenja bakterijskih okužb.

VIRI

Chan B, Sistrom M, Wertz J, Kortright K, Narayan D, Turner P; Phage selection restores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aeruginosa; Scientific Reports, vol. 6 (2016) Published by Nature Publishing Group; DOI: 10.1038/srep26717

Chatterjee M, Anju C, Biswas L, Anil Kumar V, Gopi Mohan C, Biswas R; Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options; International Journal of Medical Microbiology, vol. 306 (2016) pp. 48-58 Published by Elsevier GmbH; DOI: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004

R.A. Squires (2018); Bacteriophage therapy for management of bacterial infections in veterinary practice: what was once old is new again, New Zeland Veterinary Journal, DOI: 10.1080/00480169.2018.1491348

Emmanuel D, Anne B, Caroline B, Catherine N, Harald B, Sophie L (2009); T4 Phages Against Escherichia Coli Diarrhea: Potential and Problems, Virology, DOI:10.1016/j.virol.2009.03.009.

Jodie L M (2019); Evaluation of bacteriophage as an adjunct therapy for treatment of peri-prosthetic joint infection caused by Staphylococcus aureus, PLOS, DOI: 10.1371/journal.pone.0226574