Uporaba naravne bioluminiscence v sintezni biologiji

Uvod

Bioluminiscenca se v naravi pojavlja v različnih živih organizmih. Med njimi najdemo različne živali, bakterije in glive. Ti organizmi uporabljajo bioluminiscenco predvsem za življenje in preživetje v okolju kjer se pojavljajo. Uporabijo jo za skrivanje pred plenilci, privabljanje plena ali partnerjev, obrambo pred plenilce, opozarjanje ostalih organizmov, sporazumevanje z okolico, mimikrijo drugih organizmov itd. Zaradi privlačnega videza in praktične uporabnosti postaja bioluminiscenca vedno bolj zanimiva tudi za raziskovalce, ki jo želijo izkoristiti v drugačne, velikokrat človeku uporabne namene. Mnogo raziskav se osredotoča na možnost popestritve okolice z okrasnimi rastlinami ali celo drevesi, ki bi imela sposobnost bioluminiscence in bi zato svetila ponoči, ali za povsem estetske stvari, kot je ustvarjanje bioluminiscenčnih slik, in med drugim tudi igrač, ki bi z uporabo bioluminiscence pritegnile zanimanje množice otrok. Pri vseh omenjenih primerih pa so potrebni določeni, različno optimizirani bioluminiscenčni sistemi. V ta namen bi se poslužili encimov z želenimi lastnostmi iz primernih sistemov (med predhodno naštetimi). Pri samem načrtovanju je potrebno upoštevati, da bodo vsi bioluminiscenčni deli sistema, genetski elementi in šasija (organizem), v katero bodo nameščeni, v sinergiji. Pomembno se je tudi poglobiti na vpliv, ki ga bo novonastali organizem imel na okolje. Potrebno je zagotoviti sisteme, ki ne bodo škodovali ostalim organizmom v okolju. V ta namen se sistem lahko na več različnih načinov spremeni (optimizira), rezultat pa je boljša in varnejša uporaba novonastalega sistema (Reeve in sod., 2014).

Bioluminiscenčni deli in moduli v naravi

Bioluminiscenca se je preko let močno razvijala in spreminjala. V naravi tako sedaj obstaja več kot 30 različnih neodvisnih sistemov, ki imajo zmožnost oddajanja svetlobe. Takšnih sistemov je zagotovo še veliko neodkritih, veliko pa na žalost tudi že izgubljenih. Med organizme, ki so sposobni oddajati svetlobo štejemo različne bakterije, glive, živali, rastline idr. V organizmih je za bioluminiscenco pomemben encim luciferaza, ki katalizira reakcijo oddajanja svetlobe. Primerjava luciferaz iz različnih organizmov ne kaže homologije med omenjenimi encimi. Tudi substrati luciferaz, luciferini, iz različnih organizmov ne izkazujejo kemično podobnih lastnosti. Sintezna biologija ima omejen izbor naravnih sistemov, a se nabor povečuje, predvsem zaradi vedno večih sekvenciranih genomov. To je omogočeno v veliki meri zaradi zmanjšanja stroškov sekvenciranja v zadnjem obdobju (Reeve in sod., 2014).

Luminiscenca pri kresničkah

Med znanimi luciferazami je posebno dobro proučena luciferaza iz kresničk. Ta se tudi veliko uporablja kot reporterski gen. Za uporabo v drugih sistemih je velik problem poznavanje biokemije nastanka njenih substratov luciferinov. Leta 1974 so zaradi nepoznavanja genov, ki zapisujejo za substrate luciferaze (luciferine), predlagali uporabo proteina, ki bi recikliral luciferin. Ugotovili so, da se radioaktivno označeni oksiluciferin in 2-ciano-6-hidroksibenzotiazol (CHBT) pretvorita v luciferin, če ju vstavimo v živo kresničko. Nekaj deset let kasneje so sodelujoči protein odkrili in ga poimenovali encim za regeneracijo luciferina (LRE) (Gomi in Kajiyama, 2001). Oksiluciferin lahko blokira aktivno mesto kresnične luciferaze in je tako kompetitivni inhibitor luminiscence. Njegova odstranitev z LRE izboljša oddajanje svetlobe in vivo. Če v sistem dodamo še D-cistein, je oddajanje svetlobe še podaljšano (Sanderson in sod., 2010). Geni za de novo biosintezo luciferina bi tako morali proizvesti le nekaj tega substrata, da bi se ta potem lahko nepretrgoma recikliral preko LRE cikla. S tem pa bi omogočili neprekinjeno oddajanje svetlobe v takem sistemu. Ker pa večina organizmov ne proizvaja D-cisteina (za sesalce je toksičen, v bakterijskih celicah pa je inhibitor rasti bakterij), to povzroča težavo pri izkoriščanju LRE cikla za recikliranje luciferina preko uporabe D-cisteina (Reeve in sod., 2014). Poleg omenjenih dveh poti je predpostavljeno recikliranje D-luciferina tudi preko izrabe L-cisteina. Ta pot v sintetičnih organizmih še ni dokazana, bi pa lahko bila v prihodnosti glavna pot za recikliranje luciferina (Niwa in sod., 2006).

Luciferazo iz kresničke Photinus pyralis so leta 1986 izrazili v rastlinah tobaka pod promotorjem mozaičnega virusa cvetače. Za pridobitev luminiscence so morali raziskovalci rastlini dodati vodno raztopino z dodatkom substrata luciferina, saj rastlina sama ne proizvaja omenjenega substrata. Z omenjenim procesom so uspešno pridobili prvo transgensko večcelično rastlino, ki je izražala luminiscenco. Največ svetlobe je bilo izražene v listih in steblu rastline, saj so imeli ti predeli najboljši dostop do luciferina (Ow in sod., 1986; Reeve in sod., 2014). Edina težava za uporabo takšnih rastlin pri osvetljevanju je zaenkrat ta, da geni, ki zapisujejo za substrat luciferin, niso poznani. To je oteženo tudi zaradi dejstva, da celoten genom kresničk do sedaj še ni bil sekvenciran. Dodajanje luciferina za potek reakcije je tako sedaj še zmeraj nujno potreben za potek reakcije, kar je drag proces in zato slabo uporaben (Reeve in sod., 2014).

Bakterijska bioluminiscenca

Luminiscenčne bakterije imajo nekaj skupnih lastnosti. Vse spadajo v razred gibljivih gram-negativnih bakrterij, ki ne tvorijo spor. Gre za najštevilčnejšo in široko razširjeno skupino med vsemi organizmi, ki oddajajo svetlobo. Najdemo jih kot prosto živeče organizme v oceanih, saprofite na mrtvih morskih organizmih ter simbionte v nekaterih organih rib in lignjev. Znane luminiscenčne bakterije najdemo v rodovih Aliivibrio, Photobacterium, Alteromonas in Photorhabdus. Bakterijski encimski sistem za oddajanje svetlobe, ki ga kodira lux operon, je močno ohranjen med luminiscenčnimi bakterijami. Najpogostejšo arhitekturo operona predstavlja luxCDABEG. Za reakcijo oddajanja svetlobe uporabljajo bakterije kot substrate luciferaze flavin mononukleotide in dolgoverižne aldehide. Slednje pridobijo preko biosinteze maščobnih lipidov. LuxA in luxB gena zapisujeta za α in β podenoto bakterijske luciferaze. LuxC, luxD in luxE zapisujejo za encime, ki sodelujejo v sintezi aldehidnih substratov, luxG pa zapisuje za flavin reduktazo, ki je pomembna za nastanek flavin mononukleotidov. Operon je v sintezni biologiji zelo uporaben, saj vsebuje vse gene potrebne za bioluminiscenco, nastanek in kroženje substrata in reakcijo, ki proizvaja svetlobo. Ima pa zaradi svoje celovitosti tudi omejitve. Za uporabo v evkariontskih gostiteljskih sistemih je potrebno operon preoblikovati, saj evkariontska jedrna DNA ne vsebuje operonov in jih citosolni ribosomi tako ne morejo predelati (Reeve in sod., 2014). V 80. letih 20. stoletja so naredili bioluminiscenčne bakterije E. coli z uporabo operonov iz Aliivibrio fischeri in Vibrio harveyi (Reeve in sod., 2014).

Naredili so tudi poizkuse transformacije celic transgenskega tobaka in korenja s pomočjo Agrobacterium. Najprej so transformacijo izvedli le z zapisom za luciferazo (luxA in luxB) iz Vibrio harveyi. Proteina sta se pravilno sestavila v delujočo luciferazo, saj se je ob dodatku substratov tvorila svetloba (Reeve in sod., 2014).

Avtoluminiscenco v višjih evkariotih so uspeli proizvesti šele desetletje kasneje. Celotni operon lux iz Photobacterium leiognathi so vstavili v kloroplaste rastline tobaka, ki je proizvajal luminiscenco. Še istega leta so naredili šibko avtoluminiscenčne sesalske celice HEK293. Vzeli so gene celotnega operona iz Photorhabdus luminescens in Vibrio harveyi, ki pa so jih morali v veliki meri spremeniti. Optimizirali so rabo kodona in 6 genov v operonu je bilo razdeljenih v tri bicistronske pare, med katera so dodali mesta IRES (virusna notranja vstopna mesta ribosoma) (Reeve in sod., 2014). Ostali poizkusi so se nanašali na uporabo operona lux iz V. fischeri. Ko se je izražal pod arabinoznim inducibilnim promotorjem v E. coli z aktivacijo preko dodatka L-arabinoze, so v velikih steklenicah proizvedli ravno dovolj svetlobe, da je oseba lahko zraven brala (Reeve in sod., 2014).

Ostali naravni luminiscenčni sistemi

Zanimiva je tudi bioluminiscenca pri glivah. Kar 71 vrst bioluminiscenčnih prizemnih gliv so že opisali, a je njihovo biokemijsko ozadje zelo slabo poznano. Našli so možne luciferine, vendar poti za njihov nastanek niso poznane, tudi prisotnost luciferaz je bila potrjena ne dolgo nazaj, sekvencirana pa do sedaj ni bila še nobena med njimi. Verjetno je v ozadju še mnogo uporabnih glivnih sistemov, ki jih je najprej potrebno odkriti, kar je naloga v naslednjih obdobjih (Reeve in sod., 2014). Podobno pomanjkanje se izkazuje tudi pri drugih vrstah, ki imajo zmožnost bioluminiscence. Med njimi so bičkarji, ožigalkarji in ceponožci. Pri teh bioluminiscenčnih organizmih so poznani encimi (luciferaza) in substrati (derivat klorofila pri bičkarjih in koelentarazin pri ožigalkarjih in ceponožcih), ostale njihove biokemijske poti pa ne, kar omejuje njihovo uporabo v sintezni biologiji (Reeve in sod., 2014).

Izbira gostiteljskega organizma (šasije)

E. coli je najpogosteje uporabljena šasija v sintezni biologiji. Zanjo imamo na voljo najbolje okarakterizirane genetske dele. Dobro okarakterizirane šasije tvorijo bolj predvidljive interakcije, vendar aplikacija omejuje izbiro šasije, saj zahteva določene lastnosti ali prilagoditve na okolje. Raziskovalci so oblikovali sistem osvetljave, pri katerem bi z gospodinjskimi odpadki zagotovili energijo za bakterije, ki bi nato zagotovile osvetljavo (Reeve in sod., 2014).

Precej popularna je ideja o bioluminiscenčnih rastlinah (npr. bioluminiscenčna drevesa bi zamenjala ulične svetilke, božična drevesca). Tobak je bil prva eksperimentalna demonstracija bioluminiscence pri rastlinah, kjer je bil potreben dodatek luciferina, kot substrata. Okoli 20 let kasneje so ustvarili prvo autoluminiscentno rastlino. Krichevsky in sodelavci so uspeli ustvariti celotno funkcionalno pot bakterijske luciferaze v plastidih tobaka, da sta nastala oba luciferaza in njen substrat luciferin. To je bil tudi prvi uspešen poskus inženiringa celotne in funkcionalne tuje biokemijske multiencimske poti v plastidih. Izmed različnih luminiscentnih sistemov so izbrali bakterijski sistem emisije svetlobe, zaradi evolucijskega izvora cianobakterij. Izbrali so močan plastidni promotor in klonirali celoten operon Photobacterium leiognathi luxCDABEG. Izbrali so dve kandidatni integracijski mesti in naredili vektorje z operonom z dodanimi primernimi regijami za homologno rekombinacijo. Rastline so transformirali z bombardiranjem delcev. Imeli so srečo, da sta bila struktura P. leiognathi operona in RBS funkcionalna v plastidih Nicotiana tabacum ter da so bili RNA in proteini stabilni. Spremenili so le promotor. Kot produkt je nastala svetloba, ki je bila šibka. Celotne rastline so bile vidne s prostim očesom, šele po 5-10 min prilagoditvi na temo. Luminiscentne rastline niso imele fenotipskih razlik ali spremenjene rasti v primerjavi z divjim tipom. Torej se za proizvodnjo svetlobe ni porabila velika količina energije (Reeve in sod., 2014).

Transformacija plastidov je potencialna izbira tudi za druge rastlinske šasije. Kloroplasti so v glavnem omejeni na liste in tako se energija ne porablja za tvorbo svetlobe v koreninah. Za večji nivo uporabe bio-osvetljevanja, bi uporabili za šasije večje olesenele rastline. Veliko je zanimanja tudi za bio-osvetljevanje za estetske namene. Za uresničitev tega pa bo potrebnih še kar nekaj raziskav (Reeve in sod., 2014).

Nadzorovanje oddajanja svetlobe

Biološke sisteme želimo narediti čim bolj zanesljive, predvidljive in takšne, da jih je lahko nadzorovati. Uporaba biosenzorja zahteva, da je oddajanje svetlobe natančno kontrolirano z vhodnimi signali. V primeru osvetljevanja si oddajanje svetlobe želimo le ob določenem delu dneva ali pa si želimo, da se organizem odzove na okolje (npr. v primeru onesnaženja ali kadar je sevanje UV previsoko). Z uravnavanjem genov odgovornih za oddajanje svetlobe, lahko npr. spremenimo barvo oddane svetlobe (Reeve in sod., 2014).

Reporterji, ki oddajajo svetlobo, v glavnem uravnavajo proizvodnjo svetlobe s spreminjanjem nivoja transkripcije gena za luciferazo. Ta model se počasi odziva na spremembe, saj je razpolovna doba proteina 3-4 ure (Leclerc in sod., 2000). Z nekaterimi pristopi so destabilizirali protein, da bi dobili bolj odzivno regulacijo, vendar so ti pristopi še vedno v razvoju. V naravi poznamo primere zelo natančne regulacije luminiscence v primeru japonskih kresničk, ki so sposobne uskladiti utripe svetlobe na milisekundo natančno. To je mogoče zaradi pozicije luciferaze v peroksisomih pri kresničkah. Aktivnost živcev povzroči, da mitohondriji prevzamejo ATP ali pa ATP vstopi v peroksisome in ustvari svetlobo. Takšne vrste pristopi bodo morda potrebni, da bomo dosegli takojšnjo aktivacijo oddajanja svetlobe (Reeve in sod., 2014).

Svetlost bi se lahko povečala z omejevanjem proizvodnje svetlobe v določenih tkivih ali v določenem delu dneva. "Clock" geni (omogočajo avtoregulatorno povratno zanko pri kateri cikel aktivacije in utišanja traja en dan) pri Arabidopsis so model cirkadianega ritma in so dobro okarakterizirani (Albrecht in sod., 2008). Če bi želeli da rastline svetijo le ponoči, bi bilo smiselno, da bi imele gene za oddajanje svetlobe pod kontrolo "clock gene" promotorja. Rastline uporabljajo fotoreceptorje, da spremljajo dolžino dneva in tako nadzorujejo čas cvetenja. Zaradi tega bi lahko razvili rastline, ki bi svetile le v času cvetenja ali le v temnih zimskih mesecih (Reeve in sod., 2014). Želja raziskovalcev je razviti biosenzorje za določevanje stopnje onesnaženosti (npr. ko-reporterji za 2 različna toksina), sisteme, ki bi delovali kot naravne ure, vendar bodo za to potrebne še mnoge raziskave in nadgraditev znanja (Reeve in sod., 2014; iGEM, 2010).

Obvladovanje

Številne sintezno biološke aplikacije bioluminiscence imajo v načrtu nameren izpust modificiranih organizmov v okolje. V tem primeru je potrebno dobro poskrbeti za varnost, saj bi organizmi z modificiranimi geni lahko imeli dolgoročen vpliv na okolje. Obstajata dve glavni zaskrbljujoči vprašanji in sicer ali bi lahko GSO izpodrinil naravne vrste ali kako drugače vplivali na okolje ter ali bi lahko spremenjen ali sintezni genetski material pobegnil iz gostitelja in kontaminiral v okolju prisotne organizme? Bioluminiscenca je sama po sebi zelo varna, proteini in kemijski intermediati niso toksični in proces pa povzroči hudo breme za gostitelja, zato je zelo verjetno, da bi bil slednji izpodrinjen v okolju. V primeru, da bi GSO pobegnil, bi svetlobno onesnaževanje negativno vplivalo na druge organizme (npr. vešče in ptice). Da bi minimizirali širjenje teh rastlin, bi uporabili le sterilne semenske rastline, z mutacijami, ki bi preprečevale cvetenje, nastanek semen, cvetnega prahu. Rastline bi lahko obvladovali tudi z auksotrofijo (inženiring organizmov, ki potrebujejo zunanjo molekulo za rast, npr. metionin, biotin, avksin). Te omogočajo normalno razmnoževanje rastlin, kadar dodajamo potrebni nutrient, sicer pa preprečujejo rast. Tudi za mikrobe lahko uporabimo auksotrofijo. Takšne mikroorganizme brez težav izpodrinejo ostali mikroorganizmi v okolju. Celice lahko obvladujemo tako, da jih fizično zamejimo z alginatnim gelom. Za večcelične organizme, kot so rastline, je horizontalen prenos genov redek tako, da je genetska omejitev zagotovljena že s fizično omejitvijo. Bioluminiscenčna drevesa ne kažejo nevarnosti, da bi se razrasla v divjino, zato ni potrebe po auksotrofiji, vendar se priporoča moška sterilnost. Mikroorganizmi so podvrženi horizontalnemu prenosu genov, zato moramo preprečiti, da se sintezna DNA znajde v nenačrtovanem gostitelju. Npr. s sistemi, kjer sta plazmid in načrtovani gostitelj odvisna drug od drugega. Najučinkovitejši varnostni sistem predstavlja sintezna DNA, ki vsebuje zaporedja, ki jih lahko pravilno prevede le bakterijski gostitelj z deljenim mehanizmom transkripcije ali translacije. Eden izmed pristopov je uporaba celičnega kodona tako, da ni več enaka univerzalnem genetskem kodu. Določene kodone in z njimi povezane tRNA lahko spremenimo tako, da načrtovana gostiteljska celica vstavi drugačne ali celo nenaravne aminokisline za določene kodone. Nenačrtovan naraven gostitelj bi v tem primeru prevedel nefunkcionalen produkt. Alternativo predstavljajo ribosomi, ki prepoznajo nenaravne RBS za translacijo (Reeve in sod., 2014). Da lahko izsledimo sintezno biološke modele uporabljamo DNA črtne kode. Okoljske vzorce direktno sekvenciramo da identificiramo onesnaženost s sintetično DNA. DNA oznake so vstavili v številne genomske lokacije za pomoč pri identifikaciji sintezno bioloških celic. Ker trenutno še ne obstaja popoln posamezen mehanizem obvladovanja, se jih uporablja več naenkrat. Pomembno pa je, da se za vsak model posamezno oceni stopnja tvegana in nevarnosti (Reeve in sod., 2014).

Izboljšanje in spreminjanje oddajanja svetlobe

Bioluminiscenčna svetloba v naravi in v laboratoriju je zelo neizrazita. Z različnimi pristopi bi lahko povečali količino proizvedene svetlobe. Obstajajo številne preproste spremembe s katerimi povečamo nivo proteinov, ki oddajajo svetlobo (npr. uporabimo močnejše promotorje, boljše RBS). Če konstrukte sintetiziramo de novo lahko optimiziramo kodone genov za oddajanje svetlobe za izražanje v izbrani šasiji. V primerih, kjer operon prepišejo iz enega samega promotorja v bakteriji, izražanje v evkariontih zahteva insercijo dodatnega promotorja med vsakim genom ali insercijo zaporedij, ki se ne vežejo na ribosome , da se zagotovi ločeno procesiranje vseh proteinov (Reeve in sod., 2014). Za optimizacijo oddajanja svetlobe se morajo produkti svetlobne emisije reciklirati kolikor je mogoče učinkovito in biti na voljo za novi substrat za nadaljnje reakcije. Pristopi za dosego tega cilja vključujejo izražanje luciferin regenerirajočega encima za luciferazo kresničk ali luxG flavin reduktazo v lux operonu. Nadaljnje optimizacije bodo vključevale analizo kvantitete metabolitov pri vsaki stopnji reakcije luminiscence. Tako bodo lahko določili stopnjo, ki določa hitrost reakcije oz. procesa. Ta je lahko odvisna od količine prisotne luciferaze, luciferina ali katerega od intermediatov (Reeve in sod., 2014).

Alternativni pristop je pristop usmerjene evolucije. Začeten sistem svetlobne emisije bi lahko izrazili v bakterijah, nato pa bi na teh bakterijah izvedli mutagenezo. Optična selekcija najsvetlejših kolonij in ponavljanje tega procesa naj bi sčasoma pripeljali do modulov, ki emitirajo svetlejšo svetlobo. Prednost tega procesa je, da ni omejen od našega razumevanja katera mutacija bi lahko povečala količino proizvedene svetlobe (Reeve in sod., 2014). Spremembe v zapisih luminiscenčnih proteinov lahko privedejo do večje odpornosti na pH območje ali temperaturo. Takšna fleksibilnost bi bila zelo pomembna kadar želimo proteine izraziti v heterolognih sistemih, ki so precej različni od njihovega naravnega gostitelja. Npr. biolumuminiscenčni sistemi iz morskih živali pogosto slabo delujejo pri višjih temperaturah, ki so pogoste pri nekaterih šasijah (37 °C) (Reeve in sod., 2014). Tudi mikrookolje v katerem se pojavi bioluminiscenca je pomembno za izboljšavo reakcije emisije svetlobe. Nekatere vrste dinoflagelatov imajo specializirane organele, ki so optimizirani za bioluminiscenčne reakcije. Sintezni biologi upajo, da bodo lahko realizirali takšne strukture, saj bi jim to pomagalo optimizirati luminiscenco (Reeve in sod., 20141).

Spremembe

Spekter valovnih dolžin lahko spremenimo na različne načine in z njim barvo emitirane svetlobe v bioluminiscenčnih reakcijah. Komaj opazne spremembe v zaporedjih aminokislin encima luciferaze, so dovolj, da signifikantno spremenijo barvo emitirane svetlobe (npr. iz zelene v rdečo pri luciferazi kresničk). Alternativa spreminjanju zaporedij je sprememba pH pri kateri reakcije potekajo (Ando in sod., 2008). Drug pristop je sprememba kemijske strukture substrata za encim (D-luciferina v primeru luciferaze kresničk). Ko bo razumevanje metaboličnih procesov nastanka luciferina boljše, bodo različne variante slednjega proizvajali po encimatskih poteh. Obstaja tudi možnost, da spremenimo barvo emitirane svetlobe po tem, ko je že bila emitirana. To lahko naredimo z uporabo fluorescenčnih proteinov, ki zagotovijo, da je želena valovna dolžina daljša kot ta, ki je že emitirala. Obstaja veliko naravnih in umetno ustvarjenih fluorescenčnih proteinov s širokim razponom frekvenc vzbujanja in emisije (Reeve in sod., 2014).

Zaključek

Naravna bioluminiscenca je prijetna za oko in učinkovita, zato bo verjetno predstavljala del biološkega inženiringa v prihodnosti. Proizvodi bi služili striktno praktičnemu do povsem estetskemu namenu. Bioluminiscenca je možen vir svetlobe, vendar ne dosega takšne stopnje svetlosti kot konvencionalni načini osvetljevanja. Lahko je uporabna kot dopolnilni vir svetlobe, ki bi doprinesel k estetskemu videzu ali pa za dostavo uporabnih informacij. Naše znanje o sistemih naravne bioluminiscence in možnostih njihovega prenosa in optimizaciji je trenutno pomanjkljivo, vendar se izboljšuje. Biti moramo odgovorni pri načrtovanju in vpeljavi novih tehnologij ter upoštevati njihov širši vpliv. Prepoznati in preprečiti moramo vsako tveganje, ki bi pri tem nastalo. Bioosvetljevanje, biozaznavanje oddajanja svetlobe in komunikacija so še na začetku razvoja, vendar z nadaljnjimi raziskavami lahko dosežemo še marsikaj na tem področju.

Literatura

1. Reeve, B., Sanderson, T., Ellis, T. in Freemont, P. How synthetic biology would reconsider natural bioluminescence and its application. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2014, 145:3-30.

2. Gomi, K. in Kajiyama, N. Oxyluciferin, a luminescence product of firefly luciferase, is enzymatically regenerated into luciferin. J. Biol. Chem. 2001, 276(39):36508-36513.

3. Niwa, K., Nakamura, M. in Ohmiya, Y. Stereoisomeric bio-inversion key to biosynthesis of firefly D-luciferin. FEBS letters. 2006, 580(22):5283-5287.

4. Ow, D. W., Wet, J. R. D. E., Helinski, D. R., Howell, S. H., Wood, K. V. in Deluca, M. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science (New York, N. Y.). 1986, 234:856-859.

5. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J. in Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. BioTechniques. 2000, 29(3): 590-596.

6. Sanderson, T., Reeve, B., Masset, P., Knott, E., Hohmann, A., Handley, W., Emmrich, P., Copley, H., in Collins., B. E. glowli - Cambridge iGEM project, 2010. http://2010.igem.org/Team:Cambridge/Tools/microMeasure (dostop 15. 1. 2016)

7. Ando, Y., Niwa, K., Yamada, N., Enomoto, T., Irie, T., Kubota, H., Ohmiya, Y. in Akiyama, H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission. Nature Photonics. 2008, 2: 44-47.

8. Albrecht, U., in Ripperger, J. A. Clock Genes. 2008. https://www.unifr.ch/biochem/assets/files/albrecht/publications/AlbrechtRipperger.pdf (dostop 15. 1. 2016)