Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin

Povzeto po članku: M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020. [1]

Uvod

Uravnavanje izražanja genov in vplivanje na epigenetski spomin je ključno za procesiranje in razumevanje bioloških procesov. Sintezna biologija poskuša takšne aplikacije uporabiti pri spreminjanju in izboljšanju lastnosti človeških celic. V celicah sesalcev je najučinkovitejši način za uravnavanje izražanja genov in vplivanja na epigenetski spomin, vključevanje več regulatorjev kromatina (CR). Na primer domena KRAB (ang. Krüppel associated box), ki se pogosto uporablja v genetskih vezjih in aplikacijah, pritegne KAP1, ta pa preko kompleksa NuRD2 sodeluje z drugimi represorji, kot so npr. histonske deacetilaze (HDAC). Prejšnja dela so pokazala, da lahko kombiniranje še z nekaterimi drugimi regulatorji kromatina, kot sta MeCP2 in DNMT3A, z domeno KRAB dodatno izboljša njegovo zmožnost utišanja in epigenetski spomin [1]. Pri epigenetskem spominu ima ključno vlogo metilacija DNA. Metilacija DNA je postreplikacijska modifikacija, ki se odvija predvsem na citozinskih ostankih dinukleotidov CpG in je pomembna pri razvoju sesalskih celic in genomski stabilnosti. Metilacija DNA je v sesalskih celicah katalizirana z dvema tipoma encimov, in sicer ti. maintaince (DNMT1) in de novo metiltransferazami (DNMT3A, DNMT3B) [2].

Nanotelesa in regulatorji kromatina

Ciljanje regulatorjev kromatina (CR) na specifičnih genomskih lokacijah za uravnavanje izražanja genov, ima poseben pomen pri raziskavah v sintezni biologiji. Največjo težavo predstavlja dejstvo, da je veliko regulatorjev kromatina prevelikih in zaradi tega težavnih za delo s sesalskimi celicami. Hitro namreč naletimo na težavo, kjer zaradi velikosti težko sestavimo regulatorno orodje. Zavedati se je potrebno omejitve velikosti vključka, ki ga vstavimo v virusni vektor. V članku so razvili strategijo za regulacijo izražanja genov z uporabo nanoteles, ki privabijo endogene regulatorje kromatina. Pri razvoju nanoteles za uravnavanje izražanja genov je pomembno ciljati regulatorje kromatina, ki jih je veliko v celicah, in izbrati nanotelesa z visoko afiniteto vezave na ciljne regulatorje (CR). Razvoj takšnih funkcionalnih nanoteles, ki se lahko pravilno zložijo v celičnem okolju in se z veliko afiniteto vežejo na različne kromatinske komplekse, ne da bi pri tem motili njihovo delovanje, zahteva razvoj visokozmogljivih metod. Sistemi, opisani v članku, bi lahko služili kot platforma za razvoj izboljšanih nanoteles [1].

Rezultati

V članku so namesto, da bi izvedli fuzijo velikih regulatorjev kromatina na DNA-vezavno domeno, uporabili nanotelesa, da bi s tem pritegnili endogene regulatorje kromatina iz celice. Zaradi majhne velikosti nanoteles (15 kDa), visoke afinitete in stabilnosti so ta na veliko področjih zelo dobro orodje. V članku so pokazali, da se nanotelesa lahko uporabijo za utišanje genov in nastanek epigenetskega spomina ter za izboljšanje delovanja pogosto uporabljenih transkripcijskih efektorjev.

Nanotelesa proti GFP-CR za uravnavanje izražanja genov

Da bi preverili ali so nanotelesa primerna za pritegnitev regulatorjev kromatina, so eksperimente začeli z nanotelesom proti zelenem fluorescenčnem proteinu GFP. Pripravili so fuzijo nanotelesa z DNA-vezavno domeno reverznega tetraciklinskega represorja (rTetR). To so uporabili za pritegnitev različnih komercialno dostopnih regulatorjev kromatina, označenih z GFP, na reporterski gen (TagRFP) lokusa AAVS1 celic HEK293T. Omenjen reporter vsebuje pet operatorskih mest Tet navzgor od konstitutivnega promotorja pEF. Po dodatku antibiotika doksiciklina (dox) v celični medij, se rTetR veže na ta mesta, kar omogoča spremljanje vezave in sprostitve fuzije rTetR z nanotelesom na reporterju. S tem sistemom so mikroskopirali GFP-HP1α in GFP-HDAC5 med prehodnim izražanjem in gledali kako sta povezana z izražanjem genov v celični populaciji, kjer se izražata fuzija rTet-R-antiGFP in reporter TagRFP. Opazovali so utišanje reporterskega gena za rdeči fluorescenčni protein (TagRFP). Po petih dnevih opazovanja in dodajanja doksiciklina, je bil reporterski gen TagRFP utišan v celicah, ki pa so še vedno izražale GFP. Na podlagi teh rezultatov so nato izvedli pretočno citometrijo in kasneje izmerili utišanje reporterskih genov v celicah, ki so izražale GFP-HP1α, GFP-HP1β, GFP-HP1γ ali GFP-HDAC5.

Nanotelesa za utišanje reporterskega gena in povzročanje epigenetskega spomina

Pri tem poskusu, so testirali dve nanotelesi proti endogenim regulatorjem kromatina, in sicer antiHP1 in antiDNMT1, zaradi njune zmožnosti utišanja gena in induciranja epigenetskega spomina. Naredili so fuzijo rTetR enkrat z antiHP1, drugič pa z antiDNMT1, in jih integrirali v celice HEK293T. Obe nanotelesi sta v sistemu, odvisnem od antibiotika doksiciklina, povzročili utišanje reporterskega gena, vendar je bilo to utišanje šibkejše v primerjavi z močnim represorjem KRAB (ang. Krüppel associated box). Ugotovili so, da razlika v utišanju gena ni posledica nizke koncentracije endogenega proteina HP1 v celici, saj izražanje HP1α ni povečalo utišanja z nanotelesom antiHP1. Ta ugotovitev dokazuje, da ravni regulatorjev kromatina niso poglavitni vzrok, temveč so možni drugi vzroki, ki omejujejo učinkovitost antiHP1 za utišanje, kot je npr. kinetika vezanja nanoteles.

Avtorji članka so želeli tudi izvedeti, ali je utišanje s pomočjo nanotelesa antiDNMT1 povezano z metilacijo DNA, kajti ti. maintaince metilaza DNA (DNMT1), metilira hemi-metilirano DNA in ima nižjo katalitično aktivnost v primerjavi z de novo metiltransferazama DNMT3A in DNMT3B. Merili so razlike v metilaciji med dvema celičnima populacijama. Interakcija z nanotelesom antiDNMT1 je privedla do večje metilacije CpG na reporterju. Nivo metilacije DNA z nanotelesom antiDNMT1 pa je bil nižji kot z vezavo DNMT3B. Ko so pri celicah uporabili specifičen inhibitor DNA metiltransferaze, je ta prekinil utišanje, ki ga povzroča nanotelo antiDNMT1, vendar ni prekinil utišanja s strani domene KRAB ali nanotelesa antiHP1. To je potrdilo dejstvo, da je pri metilaciji DNA potrebno utišanje z nanotelesom antiDNMT1.

Po ugotovitvi potencialnosti uporabe nanoteles v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina, so se odločili, da bodo testirali protitelo antiDNMT1 v kombinaciji s KRAB (ang. Krüppel associated box). Ker KRAB povzroči hitro in močno utišanje gena, nanotelo antiDNMT1 pa povzroča dolgoživeč epigenetski spomin, so hoteli z njuno kombinacijo narediti orodje za hitro utišanje in dolgotrajni epigenetski spomin, ki ga lahko ustvarimo in začasno ohranimo. Pri njihovem delu, je začasna interakcija rTetR-KRAB-antiDNMT1 povzročila močno utišanje reporterja po petih dnevih. Uspešnost utišanja je bila skoraj 90-odstotna. Tak nivo utišanja sicer dosežemo z domeno KRAB, vendar z njim ne moremo izboljšati epigenetskega spomina.

S pomočjo nanoteles narejeno sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina

Orodja za uravnavanje izražanja genov in delovanjem na epigenetski spomin, ki temeljijo na nanotelesih bi lahko služila kot pripomoček pri sinteznobioloških vezjih za zaznavanje in detekcijo signalov. Celične štoparice in naprave za snemanje so pomembni sestavni deli sinteznobiološkega vezja [3]. Odziv nanotelesa antiDNMT1 predstavlja edinstveno priložnost za izvajanje zelo kompaktne štoparice, ki lahko beleži čas trajanja signala. Želeni signal je lahko povezan z izražanjem rTetR-antiDNMT1, ki ga je mogoče vezati pred genom, ki kodira za fluorescenco ali za proteine, ki sodelujejo pri celični smrti ali preživetju celic. Poskus so naredili tako, da so z dodajanjem antibiotika doksiciklina začeli z intervalom snemanja časa, medtem ko je odstranitev antibiotika interval končala. Ker je utišanje z vezavo nanotelesa antiDNMT1 precej počasno, to vodi do linearnega odziva. Dobimo namreč odvisnost deleža utišanih reporterskih genov (celic) kot funkcijo časa trajanja signala.

Zaključek

V članku so pokazali, da so nanotelesa antiGFP primerna za vizualizacijo regulatorjev kromatina in uravnavanje izražanja genov, prav tako pa lahko nanotelesa proti heterokromatinskemu proteinu HP1 in DNA metiltransferazi 1 (DNMT1) utišajo reporterski gen TagRFP. Poleg tega, so ta nanotelesa v kombinaciji z drugimi regulatorji kromatina (KRAB, DNMT3A in HDAC4) prav tako privedla do učinkovitega utišanja genov in izboljšanja epigenetskega spomina. Interakcija med rTetR-antiDNMT1- antiHP1 je povzročila utišanje genov pri približno 80 odstotkov celic, kar je več kot bi doseglo posamezno nanotelo. Poleg tega je fuzija antiDNMT1-antiHP1 močno izboljšala epigenetski spomin v primerjavi s samostojnim delovanjem domene KRAB. Nazadnje pa so s pomočjo nanoteles naredili sinteznobiološko vezje za vezavo regulatorjev kromatina, ki bi se lahko uporabljala kot celična štoparica.

Viri

1. M. V. Van, T. Fujimori, L. Bintu: Nanobody-Mediated Control of Gene Expression and Epigenetic Memory. bioRxiv. 2020.
2. O. Mortusewicz, L. Schermelleh, J. Walter, M. C. Cardoso, H. Leonhardt: Recruitment of DNA Methyltransferase I to DNA Repair Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 8905–8909.
3. N. Dalchau, G. Szép, R. Hernansaiz-Ballesteros, C. P. Barnes, L. Cardelli, A. Phillips, A. Csikász-Nagy: Computing with Biological Switches and Clocks. Nat. Comput. 2018, 17, 761–779.