Viroidi in retrocimi - krožne RNA zmožne avtonomne replikacije

Uvod

Krožne RNA (circRNA) so poseben razred dolgih nekodirajočih RNA, ki nastanejo prek posebnega načina izrezovanja intronov in spajanja eksonov (backsplicing) pre-mRNA. Prvi znani primer circRNA so viroidi, patogeni rastlinski krožni RNA, brez DNA analogov v genomu. Druga skupina circRNA so retrocimi, ki nastanejo s transkripcijo lastnih genskih lokusov in zaradi prisotnosti ribocimov zmorejo avtokatalitično kroženje ter RNA-RNA replikacijo. Kovalentno zaprta struktura zagotavlja večjo stabilnost retrocimom in viroidom, ki, kljub temu da so razvrščeni med nekodirajoče RNA, lahko potencialno kodirajo peptide, kar širi njihov biotehnološki potencial.

Krožna RNA (circRNA)

Krožne RNA (circRNA) so kovalentno zaprte, enoverižne, nekodirajoče molekule. Lahko nastanejo s povezavo 5' in 3' koncev linearne RNA, kot vmesni produkti RNA-procesnih reakcij ali prek posebnega mehanizma izrezovanja intronov in spajanja eksonov, imenovanega backsplicing. Pri backsplicingu se navzdolnje 5' spojitveno mesto (donor) poveže z navzgornjim 3' spojitvenim mestom (akceptor).

Regije pre-mRNA, ki se bodo povezale, morajo biti prostorsko blizu, kar omogočajo obrnjena ponavljajoča se zaporedja, kot so kratki razpršeni jedrni elementi (SINE), ki se nahajajo v intronskih regijah. Zaradi komplementarnosti med njimi se RNA upogne v zanko, kar vodi do tvorbe krožne molekule.

Poleg cis-regulatornih elementov pri tvorbi circRNA sodelujejo tudi trans-regulatorni elementi, kot so RNA-vezavni proteini (RBP). Ti se vežejo na specifična zaporedja znotraj intronov ter prispevajo k prostorski organizaciji pre-mRNA, ki je potrebna za učinkovito izvedbo backsplicinga in tvorbo krožne RNA. Pri sesalcih je znan primer takega proteina QKI, ki se veže na specifična zaporedja (QRE) pred in za eksoni, tvori dimere ter spodbuja nastanek circRNA. V rastlini Arabidopsis thaliana so identificirali pet proteinov s KH-domensko zgradbo, ki so homologni QKI in vsebujejo tako RNA-vezavne kot dimerizacijske domene, kar nakazuje na podobno vlogo pri uravnavanju krožnih RNA.[1][2]

Funkcije krožne RNA

Uravnavanje transkripcije

R-zanke so strukture RNA:DNA hibridov, ki nastajajo predvsem v GC-bogatih regijah in imajo pomembno regulacijsko vlogo. Lahko upočasnijo transkripcijo z vplivom na RNA polimerazo II in transkripcijske regulacijske faktorje, usmerjajo spajanje pre-mRNA v alternativne izooblike ter preprečujejo metilacijo določenih delov DNA, s čimer ščitijo pred transkripcijskem utišanjem. Prav tako so lahko povezane s pojavljanjem prelomov v DNA in s spremembami v organizaciji kromatina.[1]

miRNA spužva

Nekatere circRNA vsebujejo specifična zaporedja, znana kot miRNA odzivni elementi (MRE - microRNA response elements), ki so komplementarna določenim mikroRNA. Ko se mikroRNA veže na ta element, se ne more več vezati na svojo ciljno mRNA, kar prepreči njeno inhibicijo in omogoči večje izražanje te mRNA. Na primer, ath-circ032768 iz Arabidopsisa ima več MRE za miR472, ki sicer cilja na mRNA receptorja RPS5, pomembnega za imunski odziv. Ob stresu zaradi suše se izražanje circRNA in RPS5 poveča, miR472 pa se zmanjša. To izboljša odpornost na sušo in poveča izražanje stresno odzivnih genov, kot so RD29A in RD29B.[1][2]

Interakcije s proteini

Pri Arabidopsis thaliana so določene zunajcelične krožne RNA (circRNA) označene z metiladenozinskimi (m⁶A) modifikacijami, ki služijo kot signalne oznake za prepoznavanje s specifičnimi proteini. Med temi so m⁶A-vezavni protein GRP7 ter protein ARGONAUTE2 (AGO2), ki ima ključno vlogo v regulaciji z majhnimi RNA. Prisotnost m⁶A modifikacij omogoča vezavo circRNA na omenjene proteine, kar prispeva k njihovi stabilnosti, saj jo zaščitijo pred razgradnjo z encimi ali usmerijo v izločanje iz celice v apoplast.[1]

Viroidi

Viroidi so majhne, krožne RNA molekule, ki povzročajo bolezni pri rastlinah. Ker ne kodirajo proteinov, so za svojo replikacijo in patogenezo popolnoma odvisni od encimov gostiteljske rastline. Glede na njihovo zgradbo in biološke lastnosti so viroidi razdeljeni v dve glavni družini. [1]

Glavne strukturne značilnosti viroidov iz družin Pospiviroidae in Avsunviroidae

Večina znanih viroidov spada v družino Pospiviroidae, za katero je značilna paličasta RNA struktura s petimi funkcionalnimi domenami. V osrednji domeni (C) se nahajata centralno ohranjena regija (CCR), značilna za strukturo viroida, in notranja zanka, ki je ključna za njegovo replikacijo in določitvi gostiteljskega območja okužbe. Med replikacijo RNA nastajata tudi metastabilni strukturi lasnic Hairpin I in Hairpin II. Na drugi strani, viroidi iz družine Avsunviroidae imajo kompleksno razvejano strukturo, za kateri je značilno da vsebujejo hammerhead ribocime (HHR), ki omogočajo samorazrez RNA med replikacijo. Njihovo strukturno stabilnost pa zagotavljajo specifične interakcije med zankami. [1][3]

Replikacija viroide

Pri viroidih iz družine Pospiviroidae se replikacija odvija v jedru, kjer asimetrični mehanizem krožnega podvojevanja (rolling-circle) najprej omogoča sintezo negativne RNA, nato pa še pozitivne RNA. Pozitivne oligomere razcepi gostiteljska RNaza III, nato pa se sklenejo v krožno obliko s pomočjo DNA ligaze I. Viroidi iz družine Avsunviroidae se razmnožujejo v kloroplastu s pomočjo simetričnega mehanizma krožnega podvojevanja, pri čemer njihova RNA vsebuje hammerhead ribocime (HHR), ki omogočajo samorazrez verige. Za sklenitev monomerov skrbi kloroplastna tRNA ligaza, sintezo RNA pa omogoča jedrno-kodirana RNA polimeraza (NEP). Zaradi odsotnosti popravljalnih mehanizmov pri NEP imajo viroidi iz te družine najvišjo znano mutacijsko stopnjo med vsemi znanimi biološkimi organizmi. [1][3]

Medcelični transport in transport viroidov na dolge razdalje

Za sistemsko okužbo rastlin, viroidi prehajajo med celicami preko plazmodezem in se nato preko floemom širijo na dolge razdalje. Njihova RNA vsebuje specifične 3D strukture, ki omogočajo specifično vezavo z rastlinskimi proteini, ki sodelujejo pri tem transportu. Pri viroidu PSTVd posamezni strukturni elementi, kot so zanke 27,6 in 19, omogočajo prehode med različnimi tipi celic v listnem tkivu. CsPP2, Nt-4/1 in drugi floemski proteini, se lahko vežejo na viroidno RNA in omogočijo njen transport skozi rastlino. Poleg neposredne interakcije viroidov z gostiteljskimi proteini, viroidno izvorne majhne RNA regulirajo izražanje encimov, kot sta CalS11 in CalS12, kar vpliva na prepustnost plazmodezem. [1]

Sposobnost viroidne RNA za kodiranje proteinov

Čeprav viroidi veljajo za nekodirajoče RNA molekule, številne raziskave kažejo, da vplivajo na translacijski mehanizem rastlinskih celic. Na primer, okužba z viroidom CEVd spreminja izražanje ribosomskih proteinov S3,S5 in L10 in translacijskih faktorjev eEF2, eIF5A in eEF1A, ter povzroča ribosomski stres. Nekateri viroidi, kot sta HSVd in ELVd, vsebujejo ohranjene odprte bralne okvirje (ORF), ki bi lahko kodirali kratke peptide. Eksperimenti z umetnim izražanjem viroidnih ORF-jev, so nakazali ciljno lokalizacijo peptidov v celičnih organelih, vendar teh peptidov v naravno okuženih rastlinskih tkivih niso uspeli zaznati. [1]

Molekularni mehanizmi viroidne patogeneze

Viroidne okužbe lahko pri rastlinah povzročijo hude simptome, kot so zakrnela rast in deformacije, z aktivacijo mehanizma utišanja RNA (RNA silencing), pri čemer se tvorijo viroidno izvorne majhne RNA (vd-sRNA), ki ciljno razgrajujejo pomembne rastlinske mRNA. V primeru okužbe s HSVd, viroid dodatno vpliva na epigenetsko regulacijo z zmanjšanjem metilacije DNA ter z zaviranjem histonske deacetilaze HDA6, kar povzroči, da RNA polimeraza II napačno prepozna viroidno RNA kot predlogo in s tem spodbuja njeno replikacijo. [1]

Viroidom podobne RNA

Majhne krožne satelitske RNA (sc-satRNA) so viroidom podobne molekule, ki za replikacijo potrebujejo pomožni virus. Druga vrsta takšnih molekul je retroviroid CarSV, ki obstaja tako v RNA kot DNA obliki. Njegova RNA oblika nastane kot prepis iz DNA v okuženi rastlini. [1]

Retrocimi

Retrocim je neavtonomen retroelement, velikosti pribljižno do 1,5 kbp. Načeloma jih asociiramo z rastlinami, čeprav so tudi del živalskega genoma, pri rastlinah so daljši kot pri živalih. Samo ime retrocim, ang. »retrozyme« izvira iz njegovih dveh strukturnih lasnosti. Beseda retrocim je sestavljena iz ang. »hammerhead ribozyme« (ribocim z HHR motivom) in iz ang. »retrotransposon« (retrotranspozon). Na splošno ima rastlinski retrocim (dvokaličnic) dve tarčni mesti z podvojitvami (ang. »target site duplication«,TSD) z dvema dolgima terminalnima podvojitvenima nizoma (ang. »long terminal repeat, LTR), v katera je vključen HHR motiv (ang. »hammerhead ribozyme«, HHR) tipa 3, mesto za začetni oligonukleotid (PBS) ter polipurinski trak (PPT).[1]

Replikacija retrocimov

Retrocimska mobilnost je pogojena reverzni transkriptazi, ki jo kodirajo avtonomni retrotranspozoni, najvrjetneje iz družine Ty3-gypsy, ter tudi integrazi, ki jo prav tako kodirajo avtonomni retrotranspozoni. Po transkripciji retrocima, nastane linearna RNA z 5'-hidroksidnim in 2',3'-ciklofosfatnim koncem. Ta se nato z tRNA ligazo ligira v circRNA. Ta pa se nato razmnožuje na podlagi mehanizma krožnega podvojevanja (ang. »rolling circle mechanism«), te produkti pa se nadalno koristijo za sintezo cDNA, replikacijo circRNA, morebitno sintezo sRNA, ter morebitno translacijo. Sama lokacija replikacije retrocimske circRNA ni poznana, predpostavljeni sta dve lokaciji – jedro in kloroplast. V primeru replikacije v jedru je predpostavljena analogija z Pospiviroidi, replikacija z RNA polimerazo II. V primeru kloroplasta pa je predpostavljena analogija z Avsunviroidih, replikacija z NEP (ang. »nuclear-encoded plastid«) RNA polimerazo.[1]

Funkcije retrocimov

Dokazano je, da ima retrocimska circRNA možnost kodiranja proteinov. Vendar translacijski mehanizmi niso v celoti raziskani. Mehanizmi morajo biti CAP-neodvisni, saj je kovaletno povezana ciklična RNA. Najvrjetneje translacija poteka na osnovi m6A translacije ali pa je tudi možna translacija na podlagi IRES (ang. »internal ribosome entry sites«), ki se prav tako izogne translaciji s pomočjo 5'-CAP proteina, saj se ribosom veže neposredno na RNA. Čeprav je dokazano, da ima retrocimska RNA možnost kodiranja proteinov, njihova translacija ni dokazana (z izjemo genus Sobemovirus). Ena izmed funkcij retrocimske RNA je sistemska signalizacija (ang. »systemic signaling«), vendar končno tarčno mesto RNA ni poznano. Čeprav poznamo dva načina sistemske signalizacije, s pomočjo polipirimidinskih trakov in ali na podlagi specifičnih sekundarnih in terciarnih struktur same RNA. Na ta prepoznavna mesta RNA se vežejo proteini, kateri nadalno usmerjajo transport, premik RNA po organizmu do tarčnega mesta. Sam mehanizem signalizacije z retrocimsko RNA pa ni poznan, vendar glede na podobnosti med retrocimi in viroidi lahko predpostavimo, sklepamo, da se retrocimska RNA transportira na podoben način, kot viroidna RNA, se pravi na podlagi specifičnih sekundarnih in terciarnih struktur. Predpostavljeno je tudi, da retrocimi lahko delujejo kot nekakšne »miRNA spužve«. V živalskih in rastlinskih modelih je bilo dokazano, da circRNA deluje kot miRNA spužva, s čimer regulira akumulacijo in razgradnjo raznih mRNA. Možno pa je tudi, da so steblo-zanka strukture in dvoverižni intermediati retroelementov vir siRNA, ki nadalno regulirajo nekatere procese. [1]

Zaključek

Čeprav so nam viroidi že dokaj dolgo znani, o njih vemo relativno malo. Prav tako so retrocimi kot viroidi slabo raziskani, čeprav imajo tako eni kot drugi veliko potenciala v biotehnologiji. Ker circRNA vpliva na gensko izražanje je potencialno zelo primerna za spreminjanje rastlinske fiziologije. Prav tako pa je tudi circRNA pomembna zaradi svoje stabilnosti (kovalentne ciklizacije), uporabi se jo lahko v sistemih za izražanje proteinov. Prav tako pa circRNA lahko deluje kot miRNA spužva. Vendar, če želimo koristiti circRNA moramo najprej podrobneje raziskati njene mehanizme in razviti njim primerne tehnike za samo uporabo.[1]

Viri

[1] Lezzhov, A. A., Atabekova, A. K., Chergintsev, D. A., Lazareva, E. A., Solovyev, A. G., & Morozov, S. Y. (2025). Viroids and retrozymes: Plant circular RNAs capable of autonomous replication. Plants, 14(1), 61. https://doi.org/10.3390/plants14010061

[2] Zhou, W. Y., Cai, Z. R., Liu, J., et al. (2020). Circular RNA: Metabolism, functions and interactions with proteins. Molecular Cancer, 19, 172. https://doi.org/10.1186/s12943-020-01286-3

[3] Venkataraman, S., Badar, U., Shoeb, E., Hashim, G., AbouHaidar, M., & Hefferon, K. (2021). An Inside Look into Biological Miniatures: Molecular Mechanisms of Viroids. International Journal of Molecular Sciences, 22(6), 2795. https://doi.org/10.3390/ijms22062795