Viroidi in satelitski virusi

VIROIDI

MOLEKULARNO BIOLOŠKE ZNAČILNOSTI

Viroidi so najenostavnejši odkriti patogeni, ki okužijo le rastline. Sestavljeni so iz majhne krožne enoverižne molekule RNA velikosti med 239 in 475 nukleotidov, ki ne kodira beljakovin, a se razmnožuje s pomočjo gostiteljevih encimov. RNA molekula vsebuje informacije potrebne za znotrajcelični transport in lokalizacijo, reprodukcijo, sistemski transport ter patogenost. Viroidi povzročajo bolezni podobne virusom, čeprav so vsaj 10-krat manjši od njih in nimajo kapside. Poznamo 30 različnih vrst viroidov, ki jih klasificiramo v dve družini: Pospiviroidae in Avsunviroidae.

Pospiviroidae:

Zaradi intramolekularnih komplementarnih regij se nukleotidi sparijo tako, da tvorijo strukturo podobno dvoverižni RNA (dsRNA) in posledično paličasto strukturo celotne molekule, ki ima vmes nekomplementarne regije, te pa tvorijo izbokline. Genom ima 5 domen:

• Patogena domena (P): zaradi le par spremenjenih aminokislinskih ostankov v tej domeni lahko ločimo med blagimi, akutnimi in letalnimi simptomi okužbe

• Variabilna domena (V): ta domena se najbolj razlikuje tudi pri viroidih, ki so si sorodni

• Centralna ohranjena regija (CCR): je pomembna kontrolna regija pri replikaciji viroida

• Leva (TL) in desna (TR) terminalna domena: sodelujejo pri specifičnem povezovanju z encimi in ostalimi celičnimi proteini

Avsunviroidae:

Manj zastopana družina viroidov z le štirimi predstavniki se loči po tem, da nima ohranjene centralne regije in da tvori bolj razvejano strukturo s “kissing-loopom”. Posebnost teh viroidov pa je avtokatalitična ribocimska aktivnost, ki je ključna za replikacijo.

REPLIKACIJA

Pri rastlinah okuženih s Pospiviroidae se viroidi prenesejo v jedro, pri Avsunviroidae pa v kloroplast, kjer se podvojijo. Pri Avsunviroidae podvojevanje na način kotalečega se kroga poteka simetrično, pri Pospiviroidae pa asimetrično. Pri replikaciji so nujno potrebni gostiteljski encimi. Krožna viroidna RNA (+) služi kot matrica za sintezo (-) verige z RNA polimerazo ll (RNA pol ll) ali z v jedru zakodirano kloroplastno RNA polimerazo (NEP).

Pospiviroidae iz monomerne krožne (+) RNA sintetizirajo dolgo linearno oligomerno (-) RNA, ki služi, kot matrica za sintezo oligomerne (+) RNA. Zadnji transkript nato cepijo RNAze v monomerne linearne molekule, ki se z ligazami povežejo v zrele monomerne krožne (+) RNA. Tak mehanizem je asimetričen, saj podvojevanje po mehanizmu kotalečega se kroga deluje le za sintezo oligomerne (-) RNA.

Pri Avsunviroidae dolgo oligomerno (-) RNA, ki se tvori v prvem ciklu podvojevanja po mehanizmu kotalečega se kroga, avotkatalitično cepi “hammerhead” ribocim, tako da nastanejo monomerne linearne molekule, ki se z ligazami povežejo v monomerne krožne (-) RNA. Slednje služijo kot matrica za drugi cikel podvojevanja po mehanizmu kotalečega se kroga, ki vodi v sintezo oligomernih (+) RNA intermediatov, tej pa se nato procesirajo v monomerne krožne (+) RNA. Druga polovica cikla je simetrična prvemu, zato tako podvojevanje imenujemo simetrično. Terminalni zavoji so strukturni motivi, ki vsebujejo mesto začetka podvojevanja za transkripcijo. Po replikaciji sledi iztop iz organelov in medcelični transport skozi plazmodezmo. Viroidi vstopijo tudi v vaskularno tkivo in se prek floema razširijo po celotnem rastlinskem sistemu.

MEHANIZEM DELOVANJA

Viroidi lahko regulirajo izražanje genov svojih gostiteljev, modificirajo fosforilacijo gostiteljevih proteinov in se povezujejo z gostiteljevimi proteini, ki so ključni pri transportu RNA. Viroidi lahko modificirajo izražanje genov vključenih v odgovor na stres in obrambo rastlin, prenos signala, transport aminokislin, strukturo celične stene in zatiranje utišanja RNA.

Mehanizem utišanja RNA, ki ga rastline uporabljajo kot obrambo pred viroidi in drugimi eksogenimi RNA, je dejansko način s katerim viroidi uveljavljajo svojo patogenost. Viroidna RNA inducira mehanizem utišanja RNA, pri procesu encim Dicer cepi eksogeno RNA na manjše siRNA (dolge 21-25 nukleotidov), ki se vežejo v siRNA-riboukleazne komplekse (RISC). Novonastali kompleks lahko poišče in cepi gostiteljevo mRNA, ki je komplementarna v kompleks vezani viroidni siRNA ter tako sproži simptome okužbe. Obstaja pa tudi več hipotez, kako bi se lahko viroidi izognili temu obrambnemu mehanizmu rastlin:

1) Utišanje genov in posledično razgradnja RNA poteka v citoplazmi, medtem ko podvojevanje viroidov poteka v jedru (Pospiviroidae) ali v kloroplastu (Avsunviroidae), torej se zaradi kompartmentalizacije celice lahko izognejo razgradnji v najbolj kritičnem koraku njihovega življenjskega cikla.

2) Sekundarna strukutra viroida, posebno razvejana in kompaktna struktura viroidov iz družine Avsunviroidae bi lahko ščitila viroide pred encimi, ki sodelujejo pri utišanju genov. Poleg tega nesparjene baze in lasnične zanke preprečijo Dicerju cepitev, saj encim potrebuje dvoverižno RNA.

3) Morebitno povezovanje z različnimi gostiteljskimi proteini pa jim omogoča, da so nedostopni za encime mehanizma utišanja.

SATELITSKI VIRUSI

Satelitski virusi so sateliti, ki kodirajo lasten plaščni protein. Sateliti se lahko razmnožujejo le, če je gostiteljska celica hkrati okužena s pomočniškim virusom (ang. “Helper virus”), medtem ko pa replikacija pomočniškega virusa ni odvisna od satelitov. Pomembno je izpostaviti, da ni bilo dokazane nobene homologije v sekvencah med pomočniškim virusom ter satelitskim virusom, kar pomeni da ni nikakršne genetske povezave, razlikujejo se tudi v arhitekturi ter kompleksnosti RNA in zgradbi kapside. Večinoma jih najdemo v rastlinah, lahko pa okužijo tudi sesalce, bakterije itd. Vplivi interakcij med satelitskim ter pomočniškim virusom na okuženo rastlino so različni: satelitski virusi lahko ublažijo simptome okužbe, lahko jih popolnoma zavrejo ali pa še povečajo patogenost samega pomočniškega virusa.

ZGRADBA

Satelitski virusi imajo ikosahedralne virione velikosti 17nm s T=1 strukturo in so sestavljeni iz 60 identičnih proteinskih podenot. Z rentgensko kristalografijo so odkrili, da vsebujejo osem verižni ”jelly roll” beta sodček, ki oblikuje jedro usake kapsidne proteinske podenote. Proteinske podenote varirajo v velikosti od 17-24 kDa in zaprejo v kapsido enoverižne RNA genome v velikosti od 850 do 1250 nukleotidov, ki kodirajo protein za kapsido. 5 od prvih 16 aminokislinskih ostankov satelitskih virusov so bazične (Lys, Arg), kar kaže na to da N' končna domena plaščnega proteina interagira s satelitsko virusno RNA tekom vstavljanja v kapsido.

Primer: Satellite tobacco necrosis virus (STNV)

STNV prvi odkriti satelitni virus v rastlinah, je bil odkrit kot delec podoben virusu, prisoten v tobacco necrosis virusu (TNV), ki je deloval kot pomočniški virus.Na 5' koncu STNV RNA manjka m7Gppp kapa, ki jo najdemo ponavadi v virusni in in evkariontski mRNA. Na 5’ koncu imamo najprej neprevedeno sekvenco dolgo 29 – 39 nukleotidov. Nato sledi odprti bralni okir ORF, ki kodira 21.5 kDA velike kapsidne proteine. Po ORF-ju se nahaja domena, ki poživi translacijo (TED). Delecija domene TED na STNV RNA zmanjša translacijske zmogljivosti. 3’konec neprevedena regija ni poliadenilirana in predstavlja najbolj ohranjen del genoma.Ta regija tvori sekundarne strukture podobne t-RNA, ki so odporne na termalno denaturacijo in nukleotidno razkrajanje ter ima zato tudi pomembne biološke vloge: služi kot prepoznavna regija za replikazo pomočniškega virusa, sestavljanje plaščnih proteinov, ter interakcijo s komponentami gostitelja. Dodatne raziskave delecij so pokazale da mutacija ali delecija na STNV RNA na 5' koncu zmanjša translacijsko učinkovitost do 50%. Dokazali so, da čeprav neprevajajoča regija na 3' koncu bi lahko bila zadostna za pridobitev translacijskih iniciaciskih faktorjev ter ribosomov, je neprevajajoča regija na 5' koncu pomembna zaradi učinkovite komunikacije 5'-3' konca ter pravilne iniciacije na start kodonu AUG.

Biološke posledice STNV-ja, se za pomožni virus kažejo kot parazitski odnos, saj tekmujeta med sabo kdo bo uporabljal komponente, pomembne za virusno replikacijo. Ta lastnost satelitnih virusov se odraža v pomanjšani efektivnosti TNV-ja ter odpravi nekaterih simptomov okužbe pomočniškega virusa.

Malo je znanega o tem, kako se rastlinski satelitski virusi in njihovih pomočniški virusi podvojujejo, ter kako povzročajo simptome okužbe. Prav tako je malo znanega o samih interakcijah med satelitskimi virusi in celičnimi proteini. Sklepajo, da se pomožni virusi replicirajo preko enovijačnih (-)RNA intermediatov. Enovijačna (+)RNA se prepiše s pomočjo replikaze samega pomožnega virusa na komplementarno verigo (-)RNA, ki se podvoji v dvoverižno RNA (dsRNA), ki se nato prepiše v pozitivno enojno genomsko RNA. Do danes ni dokazov, da se tudi satelitski virusi ne bi replicirali po takem mehanizmu. V zadnjih raziskavah so dokazali, da satelitski virusi lahko povzročajo simptome okužbe preko mehanizma utišanja rastlinskih genov. Drugih vlog rastlinnskih satelitskih virusov še ne poznamo.

Primer: Hepatitis delta virus

Hepatitis delta virus (HDV) uvrščamo med satelitske viruse, saj za njegovo replikacijo in delovanje je potrebno, da je celica predhodno okužena z virusom hepatitis B. Dodatna okužba s HDV na s hepatitisom B že okužene celice, poveča bolj akutne simptome hepatitisa B. HDV namreč potrebuje plaščni antigen virusa HBV (HbsAg) za sestavljanje virusnega delca. Majhen in sferičen HDV virion velikosti 36-46nm je sestavljen iz HDV RNA genoma in hepatitis delta antigena (HDAg), vse skupaj pa je zaščiteno s plaščnim antigenom virusa HBV, HbsAg in lipidno membrano gostitelja. HbaAg ovojnica ščiti genom pred ekstracelularnim okoljem. Genom HDV je krožna negativno usmerjena RNA molekula s približno 1700 nukleotidi. Intramolekularne interakcije med bazami omogočajo tvorbo paličaste strukutre, kar spominja na genom viroidov. Replikacija prav tako kot pri viroidih poteka po mehanizmu kotalečega se kroga z avtokatalitičnim rezanjem RNA z ribocimom.

VIRI IN LITERATURA

Navarro, B., Gisel, A., et al. (2012). Viroids: How to infect a host and cause disease without encoding proteins. Biochimie, 94(7), 1474–1480. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2012.02.020

Flores, R., Gas, M. E., et al. (2009). Viroid replication: Rolling-circles, enzymes and ribozymes. Viruses, 1(2), 317–334. https://doi.org/10.3390/v1020317

Wang, M.-B., Bian, X.-Y., et al. (2004). On the role of RNA silencing in the pathogenicity and evolution of viroids and viral satellites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(9), 3275–3280. https://doi.org/10.1073/pnas.0400104101

Hawthorne, D., & Leupold, U. (1999). Biology and Structure of Plant Satellite Viruses Activated by Icosahedral Helper Viruses. Current topics in microbiology and immunology, 123-141. https://doi.org/10.1007/978-3-642-65848-8

Aldabe, R., Suárez-Amarán, L., et al.(2015). Animal Models of Chronic Hepatitis Delta Virus Infection Host–Virus Immunologic Interactions. Pathogens, 4(1), 46–65. https://doi.org/10.3390/pathogens4010046