Virusni nukleoproteinski kompleksi in njihova funkcija

Uvod

hnRNP-ji (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) so skupina proteinov, ki jih uvrščamo med RBP-je (RNA binding proteins), torej proteine, ki se vežejo na RNA preko različnih domen in tako izvajajo svoje regulatorne funkcije. hnRNP-ji se vežejo specifično na hnRNA (heterogeneous nuclear RNA, pre-mRNA) in igrajo pomembno vlogo v praktično vseh pomembnih procesih vezanih na nukleinske kisline, kot so transkripcija, izrezovanje intronov, transport in celo podaljševanje telomer – ravno to pa jih dela popolne tarče za viruse, ki za svoje preživetje izkoriščajo makromolekule gostiteljske celice. Virusi so namreč odvisni od njih tekom celotnega virusnega življenjskega cikla, ki vključuje šest glavnih stopenj: pripenjanje, vstop v celico (penetracija), slečenje (razgradnja kapside/ovojnice), replikacija in ekspresija genoma, sestavljanje in sproščanje virionov (novonastalih delcev, ki so zmožni nove okužbe) iz gostiteljske celice.

Viruse lahko v grobem razdelimo v tri skupine, RNA viruse, DNA viruse in retroviruse. Njihova glavna razlika je, kot že sama imena namigujejo, v vrsti njihovega genoma– posledično tudi hnRNP-ji opravljajo pri različnih skupinah drugačne naloge. Virusom, ki sodijo v posamezno skupino, lahko določimo tudi podskupine, ki jih označimo s kraticami, kot so ss (enoverižna) in ds (dvoverižna), ter (+) (smiselna veriga) in (-) (protismiselna veriga).

Vloga hnRNP v replikaciji in transkripciji virusnega genoma

Pri RNA virusih ima (+) ssRNA vlogo mRNA, medtem ko dsRNA in/ali (-) ssRNA predstavljata matrico za verigo, iz katere se ta mRNA prepisuje. Eden izmed bolj raziskanih RNA virusov je človeški poliovirus (PV), v katerem tekom replikacije in transkripcije igrata glavno vlogo hnRNP C in hnRNP E2. Gre za virus, katerega genom je zapisan kot (+)ssRNA, kar pomeni, da ga gostiteljska celica takoj prepozna kot mRNA in začne s sintezo proteinov, za replikacijo pa se mora najprej sintetizirati (-)ssRNA. hnRNP C se nato na (-) ssRNA veže preko domene RRM (ang. RNA recognition motif) in tam interagira s proteinom 3CD, ki je poliprotein z dvema vlogama, proteazno (3C) in polimerazno (3D). Ko se ta virusni protein prevede ob translaciji na (+)ssRNA, 3C reže na cepitvenem mestu med samim seboj in 3D, kar omogoča, da se 3D spremeni v popolnoma funkcionalno RdRp (ang. RNA-dependent RNA polymerase). Poleg tega pa ima hnRNP C tudi šaperonsko funkcijo, ki omogoča, da se (-) ssRNA zvije v takšno konformacijo, ki spodbuja sintezo (+) ssRNA. hnRNP E2 pa interagira s proteini PABP (ang. Poly-A-binding proteins) na 3’ koncu (+) ssRNA, in tako prenese aktivno RdRp s 5’ na 3’ konec. Ob tem hnRNP E2 izgubi eno izmed svojih treh RNA-vezavnih mest, kar omogoči, da se protein veže na ‘deteljasto’ strukturo na 5’ koncu (+) ssRNA. To omogoča replikacijo PV RNA, saj PABP združijo 3’ in 5’ konca virusne (+) ssRNA.

Pri DNA virusih je veliko manj interakcij med hnRNPji in virusnim genomom, najbolj znan primer je pri virusu Hepatitis B (HBV), kjer protein A3B inhibira ekspresijo virusa tako, da inhibira vezavo hnRNP K na ojačevalno zaporedje (enhancer II) na virusu HBV.

Tudi pri retrovirusih je teh interakcij manj. Pri najbolj raziskanem virusu iz te skupine, HIV, hnRNP K deluje kot ogrodje med proteinom Nef (protein, ki HIV-u omogoča še večjo infektivnost) in celičnimi kinazami, da se tvori kompleks NAKC. Ta sproži signalno pot Erk1/2, ki omogoči virusnem proteinu Tat, da sproži transkripcijo virusnega genoma. Kadar želi HIV ostati skrit pred imunskim sistemom se hnRNP G veže na provirusno DNA (virusno DNA, ki se integrira v genom), in sicer na mesto LTR (long terminal repeat), kar omogoča, da se ta DNA zvije tako, da se nanju RNA polimeraza ne more vezati in transkripcija ni mogoča. Kot nasprotje hnRNP G deluje hnRNP A2/B1 kot aktivator, saj prepozna G-kvadruplekse na LTR in se nanje veže, kar spodbuja transkripcijo.

Vloga hnRNP pri post-transkripcijski regulaciji

hnRNP-ji imajo tudi ključno vlogo kot regulatorji virusne genske ekspresije, saj sodelujejo pri številnih post-transkripcijskih procesih, vključno z alternativnim rezanjem mRNA, stabilizacijo RNA, poliadenilacijo in regulacijo translacije. Njihova vloga je še posebej pomembna pri virusih, kjer omogočajo natančno časovno in količinsko kontrolo izražanja virusnih genov. Pri RNA virusih hnRNP-ji uravnavajo razrez in stabilnost virusne RNA ter vplivajo na razmerje med različnimi proteinskimi produkti. Pri virusu influence A (gripa) je M segment primer alternativnega rezanja, kjer nerazrezana mRNA kodira protein M1, razrezana oblika pa M2, ki tvori ionski kanalček. Proteina hnRNP K in NS1-BP sta ključna za izrez introna in nastanek M2. Za virus je ključno ohranjanje ravnotežja med M1 in M2. Zmanjšana funkcija teh proteinov vodi v porušeno razmerje med M1 in M2, kar bistveno zavira virusno replikacijo, zato predstavlja hnRNP K potencialno terapevtsko tarčo. hnRNP-ji sodelujejo tudi pri stabilizaciji virusnih RNA. Poliovirus, ki je tudi RNA virus, ima mRNA molekulo, ki ne vsebuje 5'terminalne kape. mRNA, ki nimajo 5' kape, so pa v celicah podvržene razgradnji z eksonukleazami. A kljub temu, da poliovirusna mRNA nima 5' kape, je zelo stabilna, saj ima poliovirusni genom na 5' koncu strukturo deteljice, ki je dodatno stabilizirana z hnRNP-jem E. Mutacije v hnRNP E, ki preprečujejo vezavo na RNA, povzročijo destabilizacijo virusnega genoma in hitro razgradnjo RNA. Pri DNA virusih, kot je HPV (človeški papiloma virus), in retrovirusih imajo hnRNP-ji pomembno vlogo pri regulaciji razrezovanja in translacije. Pri HPV se ekspresija hnRNP A povečuje z diferenciacijo epitelijskih celic, kar vpliva na alternativno rezanje virusnih mRNA. E6 (protiapoptotski protein, ki zavira p53) in E7(protein, ki zavira retinoblastoma protein) sta dva ključna onkoproteina, ki pa nastaneta iz iste pre-mRNA. Nerezana oblika predstavlja E6, rezana pa E7. Oba gena nosita zapis za proteina, ki sta ključnega pomena za uspešno nadaljevanje okužbe zato mora biti njuna ekspresija nujno regulirana. Količina hnRNP A je pomembna za razmerje med nastankom E6 in E7 saj se poveže z elementom za utišanje rezanja in zmanjša nastanek E7., medtem ko pa hnRNP G spodbuja nastanek E2 transkripta. V pozni fazi okužbe je ključna aktivacija rezavnih mest za L1 in L2 gene, kar omogoča nastanek kapsidnih proteinov. Ta prehod je strogo reguliran, saj zgodnje izražanje kapsidnih proteinov lahko sproži imunski odziv gostitelja.

Vloga hnRNP v translaciji

hnRNP-ji imajo pomembno vlogo tudi pri translacijski regulaciji. Pri številnih RNA virusih spodbujajo translacijo preko IRES elementov, ki omogočajo vezavo ribosoma neodvisno od 5′ kape. Pri virusu hepatitisa C se hnRNP D veže na IRES v 5′ UTR regiji in omogoča učinkovito translacijo virusnih proteinov, medtem ko hnRNP Q pomaga pri pravilni poziciji ribosomske 40S podenote.

Vloga hnRNP-jev pri preklopu translacija-replikacija

(+) ss RNA virusi so virusi, katerim genski material predstavlja enoverižna RNA molekula. Ker je v tem primeru ta pozitivno usmerjena lahko hkrati služi kot mRNA in matrica za sintezo nove (-) ssRNA, preko katere lahko nato poteče replikacija. Virus mora zato prekljapljati med procesom translacije in replikacije. Po koncu translacije se mora (+) ssRNA molekula izogniti mRNA razgradnim mehanizmom, da ne izgubi matrice in lahko nadaljuje z procesom replikacije oz podvojevanjem dednega materiala. Pri regulaciji tega procesa sodeljujejo proteini hnRNP preko interakcij s cis-elementi virusne (+) ssRNA. Pri poliovirusu (PV) kot »stikalo« igra hnRNP E2. Ta vsebuje tri RNA vezavne domene (KH), preko katerih se veže na strukturo steblo-zanka IV(»stem-loop«) notranjega vstopnega mesta za ribosom (IRES) in ga stabilizira ter tako olajša vezavo ribosoma-promovira translacijo. Po translaciji in sintezi virusnih proteinov pa lahko virusna proteaza 3C/3CD cepi povezovalno zaporedje med domenama KH2 in KH3, kar onemogoči vezavo na IRES in zavre translacijo.

Vloga hnRNP-jev pri transportu vRNA

Proteini hnRNP sodelujejo tudi pri transportu virusne RNA in lahko delujejo kot pozitivni ali negativni regulatorji. V primeru hnRNP A2/B1 pri virusu influence A (IAV) se ta s pomočjo nukleoproteina (NP) veže na mRNA za protein NS1 in 2 in tako prepreči njen izvoz iz jedra in posledično sintezo proteinov. NS1 in NS2 onemogočata celični obrambni odziv z interferonom, zato zaviranje le teh zavira razmnoževanje virusa.

Na koncu virusnega cikla pride do izstopa virusa iz celice, pri čemer prav tako sodelujejo hnRNP-ji. Pri virusu dengue (DENV) hnRNP K, NS1 in vimentin (del intermediarnih filamentov-citoskelet) tvorijo kompleks, ki virione transportirajo do plazemske membrane, da lahko izstopijo iz celice.

Vloga hnRNP-jev pri izstopu virusa iz celice

Enterovirus 71 (EV71) izraža proteazo 3C, ki reže hnRNP A1, kar onemogoča vezavo na IRES za apoptotski proteazni aktivacijski faktor 1 (apaf-1). Zaradi tega se na IRES lahko veže ribosom in začne se translacija apaf-1, ki aktivira kaspazo 3 in posledično apoptozo, kar omogoča razširitev virionov. Ravno nasprotno pa hnRNP K pri virusu goveje efemerne mrzlice (BEFV) zavira apoptozo z razgradnjo virusnega proteina α3 (le ta je aktivator apoptoze, saj poškoduje mitohondrijsko membrano in sprosti citokrom c). Vendar pa ima hnRNP K vseeno podporno vlogo za virus HSV-1, saj omogoča pridobitev sekundarne ovojnice v trans-Golgijevem omrežju in sprostitev virionov po eksocitozni poti iz celice.

Vpliv nukleoplazemska kroženja hnRNP-jev na virusno replikacijo

Virus relokalizira hnRNP-je in tako onemogoči opravljanje njihove funkcije in tako promovira lastno replikacijo. Ebola virus (EBOV) prepreči hnRNP C1/2 vstop v jedro. EBOV sintetizira protein VP24, ki se veže na karioferine (KPNA), ki so odgovorni za transport hnRNP C1/2 in transkripcijskega faktorja STAT1 skozi jedrne pore v jedro. Ker VP24 inhibira KPNA, transkripcijski faktor ne pride v jedro in celica ne more sprožiti obrambnega mehanizma. Protein odprti bralni okvir 6 (ORF 6) virusa SARS-CoV-2 pa se veže na nukleoporine in fizično zapre jedrne pore. Tako onemogoči uvoz raznih transkripcijskih faktorjev in izvoza celičnih mRNA, ki nosijo zapis za obrambne proteine . Virusi kot na primer ptičji reovirus (ARV) izrabljajo hnRNP A1 za transport svojih proteinov-p17 v in iz jedra. Protein p17 v jedru aktivira kaskado p53-p21 in upočasni celični cikel ter zavira mTOR in s tem sintezo celičnih proteinov.

Zaključek

Zaradi svoje pomembne vloge v različnih fazah virusnega življenjskega cikla so hnRNP-ji odlične tarče za protivirusne učinkovine, med drugim se je pokazal potencial za zdravilo proti raku na materničnem vratu, proti Sars-Cov-2 in HRV (human rhinovirus). Pomembno pa je opozoriti, da so primeri, ki so opisani zgoraj, le primeri, in jih ne moremo posplošiti na celotne kategorije virusov, kajti nekateri mehanizmi lahko potekajo tudi obratno.

Viri

Bhattarai K and Holcik M (2022) Diverse roles of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in viral life cycle. Front. Virol. 2:1044652. doi: 10.3389/fviro.2022.1044652

Brunner JE, Nguyen JHC, Roehl HH, Ho T, Swiderek KM, Semler BL. Functional interaction of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c with poliovirus RNA synthesis initiation complexes. J Virol (2005) 79:3254–66. doi: 10.1128/JVI.79.6.3254-3266.2005

J. Wang, D. Sun, M. Wang, A. Cheng, Y. Zhu, S. Mao, X. Ou, X. Zhao, J. Huang, Q. Gao idr.: Multiple functions of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in the positive single-stranded RNA virus life cycle. Front. Immunol. 2022, 13. DOI: 10.3389/fimmu.2022.989298