Vloga TE pri razvoju zarodka

Uvod

Transpozoni so DNA zaporedja, ki lahko spreminjajo svoj položaj znotraj genoma. TE lahko ogrozijo stabilnost samega genoma, saj lahko z insercijami TE v eksonske regije povzročijo nefunkcionalnost določenih proteinov. Kljub temu je genom višjih sesalcev bogat s TE in nedavne raziskave so pokazale, da imajo ključno vlogo pri embrinalnem razvoju, specifično v obdobju predimplantacije, gastrulacije, razvoju placente in samih interakcijah matere s plodom. Vse to je omogočilo razvoj zarodka v notranjosti telesa.

Predimplantacijska faza

TE se povečano izražajo v obdobju pred implantacijo, potem pa pride do zatiranja izražanja, v večji meri s TE regulatirnimi proteini KRAB-ZFPs (Krüppel-associated protein box zinc finger proteins; skupina transkripcijskih faktorjev, ki največkrat delujejo kot represorji) v kompleksu s KAP1 (KRAB-associated protein 1). Na kompleks se lahko vežejo drugih proteini (npr. SETDB1 (SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1) in DNMTs (DNA methyltransferase)), ki povzročijo DNA modifikacije. Ker pa so KRAB-ZFP-ji specifični za TE, je omogočeno specifično utišanje TE. Če se izražajo, lahko TE vplivajo med predimplantacijsko dobo na tri načine: kot regulatorni elementi, kot transkripti in kot osnova za povečanje raznovrstnosti transkriptoma.

Kot regulatorni elementi: promotorji in ojačevalci, vsebujejo vezavno mesto za transkripcijski faktor, ob njegovi vezavi pa se poveča transkripcija. Kot promotorji največkrat delujejo LTR sekvence, ki se nahajajo blizu gostiteljskega gena. Vpliv transkriptov TE zajema izražanje genov TE, ki zapisujejo za proteine. Te lahko gostiteljski organizem »udomači« in tako pridobim protein z novo funkcijo. TE lahko služijo tudi kot osnova za nastanek novih transkriptov (insercija TE v intronske regije, TE kot regulatorni elementi za transkripcijo lncRNA ter premeščanje eksonov).

Obdobje pred implantacijo razdelilimo na totipotentno in pluripotentno fazo. Po oploditvi sledi ZGA (aktivacija zigotnega genoma, ključen korak totipotentne faze). Med ZGA se vrstno specifični TE povečano izražajo. V tej fazi je potrebno poudariti pomen ERV (endogeni retrovirusi) izvirajočega alternativnega promotorja. Na primer LTR, ki je del MuERV-L-ja (mišji ERV tipa L), služi kot promotor. Nanj se veže transkripcijski faktor DUX (Double homeobox; vsi višji sesalci vsebujejo njegov ortolog), ta je aktiven le v totipotenčnih celicah. Tako je omogočena transkripcija za totipotenčno fazo specifičnih genov. Sledi pluripotentna faza, katere prva stopnja je zgodnja blastocista (skupek celic, ki obdajajo centralno, s tekočino zapolnjeno votlino - blastocel). Notranja skupina celic blastociste tvori embrioblast, iz katerega se kasneje razvije zarodek. Celice, ki kot obod obdajajo blastocel, pa tvorijo trofoblast. Primer vpliva TE na razvoj v TSC (trofoektodermalne matične celice) je ERV izvirajoč ojačevalec RLTR13, nanj se lahko vežejo trije transkripcijski faktorji (specifični trofoektodermalni regulatorji): Eomes, CDX2 in ELF5. Služi kot ojačevealec kar 100 gostiteljevih genov. Razvoj v pluripotentne TSC pa je nujen, saj v kasnejši fazi pripomore k nastanku placente. ESC (embrionalne matične celice) vsebujejo esencialene pluripotentne transkripcijske faktorje, na primer: OCT4 (miši) NANOG, OCT5 in LBP9 (človek). Ti se vežejo na ERV izvirajoče ojačevalce ERV-K in prav tako omogočijo transkripcijo za pluripotentne celice specifičnih genov. Primer LTR elementov ERV-K, ki specifično vežejo OCT4 v ESC, so LTR5HS. Ob njihovi represiji, se spremeni izražanje kar 71% genov. To je dokaz, da je vzorec izražanja TE specifičen za ta tip celice. V človeških ESC se povečano izražajo HERV-H (človeški ERV tipa H). LTR del HERV-H poimenovan LTR7 ima promotorsko aktivnost in tako poveča transkripcijo bližnjih genov, kot tudi lncRNA. Z izbitjem HERV-H je prišlo do indukcije diferencij celic in posledično izgubo pluripotenčnosti.

Raziskave potrjujejo, da imajo TE, predvsem ERV-ji, ključno vlogo v pred implantacijski fazi. Vzorci izražanja TE so specifični za določen tip celice.

Gastrulacija

Po implantaciji, se blastocista razvije v plod ter v funkcionalno placento. Preden pa se to lahko tvori, se zarodku med procesom gastrulacije oblikuje embrionalen vzorec: nastanejo ekto-, mezo- ter endoderm, iz katerih se bodo nato razvila posamezna tkiva ter organi.

Težko je ugotoviti, ali je ekspresija TE sploh pomembna za gastrulacijo, ampak obstajata dve vrsti dokazov, ki kažeta, da je utišanje transpozonov bistveno za razvoj. Prvi kažejo, da je prisilno izražanje kodonsko optimiziranih elementov LINE1 med razvojem (z uporabo inducibilnega transgena) povzročilo povečanje retrotranspozicije in embrionalne smrtnosti. Iz tega vidimo, da je lahko visoka obremenitev z retrotranspozonom tudi smrtna. Drugi pa kažejo na to, da izguba večih regulatorjev TE vodi do smrtonosnih okvar gastrulacije. Na primer, izbris gena Trim28 (gen, ki kodira KAP1) ali Setdb1 (gen, ki kodira Histon-lizin N-metiltransferazo) povzroči globalno reaktivacijo ERV, kar pa povzroči smrtnost pred gastrulacijo. Bistvene vloge med gastrulacijo imajo tudi številni drugi regulatorji kromatina, ki sodelujejo s KAP1. Taki so npr. DNMTs ali pa komponente kompleksa HUSH, kateri utiša neintegrirano retrovirusno DNA in mlade elemente LINE1 (retrotranspozoni). Brez KAP1 ali DNMTs postanejo geni, ki so običajno omejeni na izvenembrionalna tkiva, ektopično izraženi (začnejo se izražat nekje drugje). Okvare oz. mutacije v KAP1 ali SETDB1 prispevajo k zgodnjim fenotipom: kadar embrionalna ter izvenembrionalna tkiva nimajo KAP1 ali SETDB1, zarodki ne morejo sprožiti gastrulacije, ker imajo napako v embrionalnem vzorcu. Ko pa manjka samo eden izmed njiju se embrionalni vzorci delno obnovijo in gastrulacija se lahko začne. Ti pogojni mutantni zarodki pa vseeno ne morejo uspešno dokončati gastrulacije. Te ugotovitve močno kažejo na to, da je ekspresija KAP1 in SETDB1 pomembna tako za embrionalni kot izvenembrionalni razvoj.

Takoj ob implantaciji, ZFP568 (to je tip KRAB-ZFP-jev, ki imajo bistvene funkcije med razvojem ter uporabljajo KAP1 za kofaktor in SETDB1 kot ko-represor) zavira placentno specifični promotor inzulinu podobnega rastnega faktorja 2 (Igf2-P0), ki poveča raven placentnega IGF2. IGF2 je pomemben, saj njegova signalna pot kontrolira materino oskrbo ploda ter njegove potrebe po hranilih. Za izražanje IGF2-ja skrbi ZFP568 – v zarodku njegovo izražanje zatira, medtem ko ga v placenti omogoča. V embrionalni liniji so lahko funkcije KAP1 v veliki meri odvisne od Zfp568, saj njegova izguba vodi do podobnih fenotipov kot okvare gastrulacije, ki jih povzroča pogojna delecija KAP1. Medtem ko je povečanje ravni IGF2 do približno trikrat združljivo z razvojem, je popolna derepresija in posledično nekajkrat povečano izražanje Igf2 v odsotnosti Zfp568 toksična. Okvare gastrulacije, ki so odvisne od ZFP568 pa je mogoče rešiti skoraj do rojstva z odstranitvijo očetovega alela Igf2, iz katerega vtisnjen Igf2 uravnava embrionalno rast prek posteljice.

Interakcije med materjo in plodom

Po gastrulaciji je ključno, da matere višjih sesalcev zarodku zagotovijo kisik in hranila. Izmenjava pa poteka v placenti na vmesniku med materjo in plodom, kjer se stikata embrionalna in materina kri. Pri razvoju funkcionalne placente pa so pomembni regulatorji (npr. ZFP568 in KAP1), ki so pomagajo pri fuziji placente, kot tudi proteini, pridobljeni iz transpozonov, ki oblikujejo funkcionalno placento na sredini nosečnosti. Tako pri miših kot pri človeku so za celično fuzijo odgovorni iz virusnih env-kodirajočih proteinov pridobljeni sincitini. Funkcija sincitina pa ni le celična fuzija temveč tudi zaviranje protivirusnega odziva gostitelja, saj deluje kot plaščni protein. Sicer pa sincitin ni edini protein, ki je odgovoren za funkcionalno placento. Poznamo še druge erv-kodirajoče proteine (gag in pol), ki jih je organizem »udomačil« za ključne funkcije placente. Na primer proteina PEG10 (paternally expressed gene 10) in PEG11. PEG10 se izraža tako pri vrečarjih, višjih sesalcih kot pri mišjih celicah TSC (trofoektodermalne matične celice), kjer je odgovoren za formacijo labirinta, spongiotrofoblasta (to je srednji del placente med labirintom in zunanjo plastjo) in diferenciacijo TSC celic. Deluje na principu zajemanja in stabilizacije placetalne RNA in z njihovo izmenjavo komunicira med celicami. PEG11 pa prepreči, da zunanja plast trofoblasta fagocitira sosednje endotelne celice, ki oblegajo zarodkove kapilare v placenti pri miših. Ob odsotnosti tega proteina se kapilare zamašijo in posledično pride do slabše formacije zarodkove kapilarne mreže.

Z razvojem višjih sesalcev in same placente se pojavita dva konflikta:
- genski konflikt,
- konflikt med materjo in plodom.

Genski konflikt se pojavi, ker zarodek za sredstva sedaj tekmuje z materjo, ne več z očetom. Pojavi se nestrinjanje genomov glede porazdelitve sredstev. Konflikt se reši z epigenetskim vtisnjenjem pogosto preko placente, kjer se izrazi veliko vtisnjenih genov. Pogosto so pri tem ključni KRAB-ZFP-ji.

Zarodne celice do obdobje gastrulacije preidejo 2 vala demetilacije, zato le malo vtisnjenih lokusov obdrži za starše specifične 5mC oznake. Tako je treba te vtise izbrisati in vzpostaviti nove glede na spol. ICR-ji (imprinting control regions) se pogosto prekrivajo z LTR-ji. Te kontrolne regije se od preostalega zaporedja razlikujejo v obogatitvi s specifičnimi TGCCGC motivi, ki jih prepoznata Zfp445 in Zfp57, ki skupaj vzdržujeta vtisnjenje tako, da se vežeta na motiv metiliranega heksanukleotida. Nanj se naloži KAP1-SETDB1, odgovoren za odlaganje H3KPme3. Tako ICR ščiti pred pasivno in aktivno demetilacijo.

Konflikt med materjo in plodom je pojav imunoloških izzivov, ki so posledica invazivne placentacije. Za rešitev tega konflikta se za višje sesalce specifične periferne regulatorne T celice infiltrirajo v mišjo deciduo. Za razvoj teh celic pa je nujen transkripcijski faktor FOX3, katerega ekspresija je odvisna od CNS1 (ohranjeno nekodirajoče zaporedje), ki je izražen iz SINE retrotranspozon družine. Ob odsotnosti CNS1 se v deciduo infiltrira veliko več T celic, kar spominja na človeške z nosečnostjo povezane motnje kot na primer preeklampsija.

Drugi primeri vpliva transpozonov na razvoj zarodka:

- Prolaktin pripomore k proliferaciji in citotoksičnosti naravnih celic ubijalk, ki regulirajo invazijo placente. Določenih retrotranspozoni so kolonizirali lokus gena za prolaktin pri različnih vrstah sesalcev. MER77 (medium reiteration frequency interspersed repeats) pri miših in MER39 pri primatih sta zagotovila vezavna mesta za transkripcijska faktorja SP1 in ETS1, katerih sinergija je omogočila močno aktivnost prolaktinskega promotorja, iz česar lahko sklepamo da so ti erv-ji prispevali k bolj invazivni placentaciji, kar med drugimi omogočalo razvoj večjih možganov.
- Prisotnost THE1B (transposon-like human element 1B) vpliva na abnormalno izražanje CRH (corticotropin-releasing hormone), kar povzroči daljšo nosečnost.
- Prisotnost treh transpoznov, vplivajo na izražanje gena WNT5a, ki omogoča, da se nosna in ustna votlina ločita, kar je ključno da lahko sesalci dihajo in sesajo hkrati.

Po vseh teh informacijah lahko zaključimo, da so bili proteini, izraženi iz TE, tako kot sami TE, ključni pri razvoju plancetalnih oz. višjih sesalcev.

Viri in literatura

[1] Senft AD, Macfarlan TS. Transposable elements shape the evolution of mammalian development. Nat Rev Genet. 2021;22: 691–711. doi:10.1038/s41576-021-00385-1
[2] Garcia-Perez JL, Widmann TJ, Adams IR. The impact of transposable elements on mammalian development. Development. 2016;143: 4101–4114. doi:10.1242/dev.132639
[3] Chen Y, Wang K, Gong YG, Khoo SK, Leach R. Roles of CDX2 and EOMES in human induced trophoblast progenitor cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2013;431: 197–202. doi:10.1016/j.bbrc.2012.12.135
[4] Lu X, Sachs F, Ramsay L, Jacques P-É, Göke J, Bourque G, et al. The retrovirus HERVH is a long noncoding RNA required for human embryonic stem cell identity. Nat Struct Mol Biol. 2014;21: 423–425. doi:10.1038/nsmb.2799
[5] Greenberg MVC, Bourc’his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20: 590–607. doi:10.1038/s41580-019-0159-6